抑癌小G蛋白ARHI与核受体TR3相互作用并通过线粒体途径促进人胃癌细胞的凋亡与自噬

摘要

ARHI是一个母源性抑癌印记基因，属ras/rap超家族成员，在人类多种正常组织中高表达，而在人卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、肝癌等多种肿瘤中表达明显下调或缺失。ARHI可以调节细胞周期控制细胞增殖，并通过多种途径参与细胞的凋亡和自噬。核孤儿受体TR3属于类固醇/甲状腺受体超家族，几乎参与人体所有组织和器官的功能调节。TR3作为转录因子调控基因表达，参与细胞增殖和凋亡调控过程，还可以作为功能蛋白，通过蛋白亚细胞定位、蛋白相互作用和蛋白修饰等途径发挥作用。本课题研究两个蛋白是否结合及其结合模式，ARHI对TR3核浆定位及生物学功能的影响，探讨两者结合后对胃癌细胞的生物功能影响。
　　首先通过免疫荧光共聚焦及内源性免疫共沉淀方法观察到ARHI与TR3共定位于细胞浆，应用外源性免疫共沉淀实验发现两者结合的位点是TR3的LBD片段和DBD片段，构建ARHI的N端缺失突变体质粒，用Co-IP实验证明了ARHI的功能区NTD在结合中的重要性。其次通过免疫荧光共聚焦及核浆分离实验证明ARHI可使TR3滞留于细胞浆并定位于线粒体，运用western blotting及荧光素酶LUC活性检测方法分别证明了ARHI蛋白表达的增加可以使TR3磷酸化程度提高及TR3转录激活能力下降。最后通过western blotting检测凋亡及自噬相关蛋白的表达情况提示ARHI和TR3结合促进了胃癌细胞的凋亡和自噬。
　　综上，得出结论:ARHI能够与TR3结合并使TR3定位于线粒体，ARHI蛋白的表达增加可以使TR3的磷酸化程度提高和转录激活能力下降，两者相互作用促进了胃癌细胞的凋亡和自噬。本实验结果揭示了ARHI在胃癌的发生发展中具有举足轻重的作用，是以ARHI为靶点的抗肿瘤研究的新探索及补充，对研究胃癌的发生发展机制具有重大的理论意义并对胃癌的治疗有潜在的医疗价值。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 抑癌小G蛋白ARHI的研究进展

1．1．1．ARHI的发现和分子结构

1．1．2 ARHI的生物学功能

1．1．3．ARHI在消化系统中功能及机制

1．1．4．ARHI在肿瘤细胞中的作用机制

1．2．TR3在胃癌细胞中的调控作用

1．2．1 TR3的概述

1．2．2 TR3在胃癌细胞的调控机制

1．3．细胞凋亡与自噬

1．3．1 细胞凋亡概述

1．3．2 细胞凋亡通路

1．3．3 细胞自噬概述

1．4 本课题研究的意义

第二章 材料及方法

2．1．材料

2．1．1 细胞、菌株、质粒

2．1．2 实验抗体

2．1．3 仪器

2．1．4 试剂

2．1．5 主要溶液的配制

2．2 实验方法

2．2．1 蛋白定量

2．2．2 ΔNTD重组质粒的构建

2．2．3．细胞培养

2．2．4 质粒的提取与储存

2．2．5 转染

2．2．6 免疫印记法

2．2．7 免疫荧光共聚焦实验

2．2．8 核浆分离

2．2．9 免疫共沉淀实验

2．2．10．荧光素酶LUC活性测定实验

第三章 结果与分析

3．1 ARHI与TR3相互作用及结合模式验证

3．1．1 ARHI和TRB结合验证

3．1．2 ARHI和TR3结合模式验证

3．1．3 小结

3．2 ARHI对TR3核浆定位及生物学功能的影响

3．2．1 ARHI促进TR3滞留胞浆

3．2．2 ARHI影响TR3磷酸化及转录激活能力

3．2．3 小结

3．3 ARHI与TR3相互作用促进细胞凋亡与自噬

3．3．1 ARHI与TR3结合促进细胞凋亡与自噬

3．3．2 小结

第四章 讨论与展望

4．1 ARHI和TR3结合后促进胃癌细胞凋亡的机制

4．2 ARHI和TR3结合后促进胃癌细胞自噬的机制

4．3 展望

参考文献

英文缩略词表

致谢

硕士期间发表的学术论文及奖励