PI3K和MAPK抑制剂对FOXO1的活性调节及其对胃间质瘤细胞系GIST-T1细胞生物学行为的影响

摘要

胃肠道间质瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是消化道最常见的间叶组织肿瘤。目前普遍认为GISTs起源于向cajal细胞分化的原始间叶细胞或幼稚干细胞，具有多向分化特征，可以向平滑肌、神经分化或不定向分化，是一种具有恶性潜能的胃肠道肿瘤，但其确切起源尚不明确。其发病率为1～2/10万人口，似乎正逐渐增加。近年来有研究表明，PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路活性在胃肠道间质瘤显著增高。MAPK通路和PI3K通路是传递细胞增殖信号的两个重要通路，二者之间存在一定程度的相互作用，而FOXO1蛋白正处于这两种信号途径的共同交汇点，参与细胞增殖与凋亡调节。FOXO是Forkhead蛋白家族的一个亚群，其中FOXO1是FOXO家族中发现最早的成员之一。有研究证实FOXO1是抑癌基因，能够影响肿瘤的发生、发展。PI3K/Akt（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK/ERK MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号传导通路均可调节FOXO1转录因子的活性，在这两条信号通路异常激活的作用下，FOXO1蛋白分子中的保守性位点发生磷酸化并从胞核输出，与14-3-3蛋白在胞质内结合，从而封闭了自身的核定位序列并定位于胞质中，远离了其自身的靶基因，进而抑制了FOXO1因子对靶基因的转录调控，并通过调节下游细胞周期及凋亡相关信号分子Bim、Bcl2、Bax等，影响细胞周期的进程和凋亡事件。已有研究指出下调FOXO1能够促进肿瘤细胞的增殖，但其确切机制尚不清楚。
　　目的：本实验选取WI-38细胞（人成纤维细胞）与GIST-T1（胃间质瘤细胞）作为研究对象。采用PI3K信号通路抑制剂LY294002和MAPK信号通路特异性抑制剂UO126单独或联合处理细胞，研究胃间质瘤中FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达，以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路对FOXO1的活性调节对胃间质瘤细胞生物学行为的影响。研究胃间质瘤中FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达，以及PI3K（磷脂酰肌醇-3-激酶）和MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路对FOXO1的活性调节对胃间质瘤细胞生物学行为的影响。
　　方法：采用免疫细胞化学染色对GIST-T1细胞系进行鉴定;Western blot检测FOXO1、Bcl2、Bax蛋白在胃间质瘤细胞系GIST-T1中的表达，以及PI3K信号通路抑制剂LY294002和MAPK信号通路特异性抑制剂UO126单独或联合处理细胞后FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax等相关蛋白表达的变化;CCK-8法检测其对细胞增殖的影响;免疫荧光法检测FOXO1蛋白在GIST-T1细胞中的细胞定位的变化。流式细胞术检测药物作用后细胞凋亡及细胞周期变化。
　　结果：细胞c-kit免疫细胞化学染色结果阳性。CCK-8结果显示，LY294002和UO126单独、联合处理组GIST-T1细胞较DMSO组增殖明显受到抑制(P＜0.05)，且呈时间依赖性。Western blot结果显示，与对照组WI-38细胞（人成纤维细胞）相比，GIST-T1细胞中总FOXO1蛋白及Bax蛋白表达相对较低，p-FOXO1、Bcl2蛋白表达相对较高。LY294002和UO126单独、联合处理后，总FOXO1蛋白表达水平未见明显变化(P＞0.05)，而p-FOXO1及Bcl2蛋白表达下降(P＜0.05)，Bax蛋白的表达增加(P＜0.05)。免疫荧光显示药物处理后FOXO1在GIST-T1细胞中的细胞核移位明显增多。LY294002和UO126联合处理GIST-T1细胞较药物单独应用时蛋白表达变化及细胞定位变化均增加(P＜0.05)。流式细胞仪检测发现药物处理组细胞凋亡明显增加，细胞周期G1期细胞比例增加，S期细胞比例下降，且联合用药组作用效果更加显著。
　　结论：培养的GIST-T1细胞c-kit免疫细胞化学染色阳性;PI3K和MAPK抑制剂能够抑制胃肠道间质瘤细胞系GIST-T1细胞增殖。PI3K和MAPK抑制剂能够通过调节FOXO1磷酸化，使FOXO1由胞浆向胞核移位;PI3K和MAPK抑制剂能够增强FOXO1转录活性，调节下游Bcl2和Bax的表达，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡;PIK和MAPK抑制剂在抑制GIST-T1细胞增殖，促进GIST-T1细胞凋亡方面具有交互作用。

目录

声明

摘要

前言

1．1 胃肠道间质瘤概述

1．2 PI3K与MPK信号通路概述

1．3 FOXO1概述

参考文献

第一章 胃肠道间质瘤细胞GIST-T1细胞学鉴定及其肿瘤相关因子表达情况

1．1 材料与方法

1．1．1 主要试剂及耗材

1．1．2 主要仪器和设备

1．2 细胞的培养

1．3 免疫细胞化学染色法对GIST-T1细胞肿瘤表面标志物c-KIT进行检测

1．4 Western blot检测FOXO1、Bcl2、Bax蛋白在胃间质瘤细胞系GIST-T1中的表达

1．5 结果

1．5．1 免疫细胞化学染色检测胃间质瘤细胞的标志物

1．5．2 FOXO1、Bcl2、Bax蛋白在胃间质瘤细胞系GIST-T1中的表达

1．6 讨论

参考文献

第二章 PI3K抑制剂和MPK抑制剂通过对FOXO1活性调节影响GIST-T1细胞的生物学行为

2．1 材料

2．1．1 主要试剂及耗材

2．1．2 主要仪器和设备

2．1．3 药物

2．1．4 细胞系

2．2 方法

2．2．1 CCK-8检测GIST-T1细胞的增殖抑制率

2．2．2 实时荧光定量PCR法检测cDNA样本中FOXO1、Bcl2、Bax基因相对含量

2．2．3 RNA抽提

2．2．4 RNA完整性和质量的鉴定

2．2．5 去除总RNA样本中基因组DNA反应

2．2．6 反转录反应体系

2．2．7 实时荧光定量PCR

2．2．8 Western blot检测FOXO1、p-FOXO1、Bcl2、Bax蛋白的表达

2．2．9 免疫荧光检测FOXO1的细胞定位变化

2．2．10 流式细胞术检测细胞凋亡

2．2．11 流式细胞术检测细胞周期

2．2．12 统计学方法对数据进行分析

2．3 结果

2．3．1 CCK-8

2．3．2 RNA纯度鉴定

2．3．3 RNA完整性测定

2．3．4 Real Time PCR

2．3．5 Western blot

2．3．6 免疫荧光检测FOXO1的亚细胞定位

2．3．7 流式细胞术检测细胞凋亡

2．3．8 流式细胞术检测细胞周期

2．4 讨论

参考文献

全文结论

在学期间科研成绩

致谢