剧毒卡罗藻和米氏凯伦藻(甲藻)Ⅰ-型Ru BisCO基因(rbc L)在磷限制及不同温度刺激条件下的表达研究

摘要

近些年来，在全世界范围内，有害藻类水华(harmful algal bloom，HAB)的不断发生，导致了严重的经济损失而且还危害到人类的生命健康，所以得到越来越广泛的重视。在各种影响和控制HAB的因素中，浮游植物生长过程中的基本必需营养要素——营养盐扮演着重要的作用。从生物学角度来说，环境中的营养盐将会影响浮游植物的生物量和生长速率，因而浮游植物对营养盐变化的响应将会深刻影响对其生长、暴发性增殖以及毒素等的重要生理过程。据此我们通过研究不同浮游植物对于不同条件下的生理及分子水平响应，将有助于解决很多实际问题，比如赤潮的发生演变以及防治等。
　　为此我们研究了特殊的位于三级内共生甲藻质体内编码的控制光合固碳效率的重要基因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因rbcL的表达，以期研究其在磷限制条件下的反应。磷作为生产生活中经常会用到的营养元素，在农业、工业以及生活上的应用非常广泛，这也使得磷营养盐的点源非点源污染对于河流和近海海区的富营养化有着十分重要的贡献。本实验结合了，在我国海区甚至内陆径流上经常成为赤潮优势种的甲藻剧毒卡罗藻(Karlodinium veneficum)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)，选取甲藻中特殊的三级内共生叶绿体的催化固碳的关键因核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基的基因rbcL，研究该基因在磷限制条件下的表达差异，为了探寻在磷营养盐变化条件下，rbcL的表达差异，以期得到甲藻在磷富余或限制条件下的变化。
　　本文选定两种有毒甲藻剧毒卡罗藻(Karlodinium veneficum)和米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)，主要研究这两株藻在磷限制条件下rbcL基因表达的响应模式。除此之外，我们还研究了在不同温度下和昼夜光暗周期中rbcL表达水平的变化趋势。
　　为了研究在剧毒卡罗藻和米氏凯伦藻的rbcL，首先通过数据采集分析，从相似的种属的rbcL的基因中进行比对分析，确定保守氨基酸编码区后设计多态性引物，通过多轮PCR扩增获得片段，纯化克隆测序之后获得特异性的rbcL序列，比对分析各个序列避开多态性区，设计获得十分特异高效的引物;结合cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends，RACE)分别扩增获得两株甲藻中rbcL基因cDNA的3'端编码序列以及拟降解转录本的rbcL的特征。采用实时定量PCR(real Time-quantitative PCR，RT-qPCR)技术，研究在不同磷培养条件下以及不同温度下该基因转录水平的变化和昼夜周期变化趋势。
　　取得主要结果如下:(1)获得包括了3'末端的长度为1276 bp的剧毒卡罗藻的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因Kvrbc;(2)获得包括了3'末端的长度为919 bp的米氏凯伦藻的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基基因Kmrbc;(3)在溶解态无机磷(dissolved inorganic phosphorus，DIP)限制培养条件下，两株目标藻培养液中的细胞生长得到显著抑制，然而rbcL基因均没有出现下调的趋势;(4)在磷限制条件下，两株藻的rbcL基因转录本的拟降解转录本却出现了明显的上升;(5) Kvrbc与光暗昼夜周期是有相关性的，然而在磷限制条件下会被打破;(6)获得了Kvrbc和Kmrbc的3'末端结构特点，以及拟降解转录本的rbcL转录本(dT-rbcL)的3'末端结构结构特点。

目录

声明

摘要

第1章 绪论

1．1 甲藻的生态学影响、结构和进化分类上的主要特征

1．1．1 甲藻的生态学影响

1．1．2 甲藻结构特征及进化分类上的主要特征

1．2 海洋生物中生物中的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶的功能、类型、进化关系及对外部条件的响应

1．2．1 浮游植物核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶的类型

1．2．2 浮游植物核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶之间的进化关系

1．2．3 浮游植物核酮糖1，5-二磺酸羧化酶／加氧酶对外部条件的响应

1．3 海洋环境中磷的分布及磷限制

1．3．1 海洋环境中磷的分类、分布及利用

1．3．2 海洋环境中的磷限制

1．4 本论文的研究目的和内容

参考文献

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．2 实验仪器

2．3 应用软件与生物信息学网站

2．4 实验方法

参考文献

第3章 剧毒卡罗藻(Karlodinium veneficum)的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因3’端cDNA序列及其表达调控

3．1 摘要

3．2 引言

3．3 材料和方法

3．4 结果

3．4．1 剧毒卡罗藻核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基编码基因Kvrbc的3’端长cDNA序列

3．4．2 剧毒卡罗藻中拟降解转录本Kvrbc(dT-Kvrbc)的3’端cDNA序列

3．4．3 昼夜周期变化实验中磷限制组的S期细胞数目明显减少

3．4．4 无机磷限制培养下Kvrbc的昼夜周期变化规律以及非下调表达

3．4．5 10℃和30℃下Kvrbc的非下调表达

3．4．6 拟降解转录本的Kvrbc(dT-Kvrbc)基因拷贝数相关性分析

3．5 讨论

3．5．1 剧毒卡罗藻中Kvrbc基因的特性

3．5．2 无机磷限制培养下Kvrbc的非下调表达

3．5．3 Kvrbc基因拷贝数对温度的响应

3．5．4 拟降解转录本的dT-Kvrbc基因拷贝数对磷的响应

3．5．5 磷限制条件下的细胞周期实验

3．6 小结

参考文献

第4章 米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi)的核酮糖1，5-二磷酸羧化酶／加氧酶大亚基基因3’端cDNA序列及其表达调控

4．1 摘要

4．2 引言

4．3 材料和方法

4．4 结果

4．4．1 短凯伦藻中碱性磷酸酶编码基因Kmrbc的3’端cDNA序列

4．4．2 米氏凯伦藻中拟降解转录本Kmrbc(dT-Kmrbc)的3’端cDNA序列

4．4．3 无机磷限制下Kmrbc的非下调表达

4．4．4 拟降解转录本的Kmrbc(dT-Kmrbc)基因拷贝数相关性分析

4．5 讨论

4．5．1 米氏凯伦藻中Kmrbc基因的特性

4．5．2 Kmrbc基因拷贝数对磷的响应

4．5．3 拟降解转录本的dT-Kmrbc基因拷贝数对磷的响应

4．6 小结

参考文献

第5章 小结

致谢