排斥导向分子RGMb/Dragon在结直肠癌发生发展中的作用与机制研究

摘要

结直肠癌是我国甚至全球范围内最常见的肿瘤之一，也是肿瘤相关死亡的主要原因之一。及时而有效的诊断是降低结直肠癌死亡率的重要措施。除了临床上常规的诊断及治疗方法外，人们也在不断致力于新型肿瘤标志物的研究，以进一步明确结直肠癌发生发展的机制。排斥导向分子(RGM)家族成员RGMb，又名Dragon，作为骨形态发生蛋白(Bone morphogenetic protein，BMP)通路的辅助受体，不但承载着胚胎发生、神经修复和肾脏正常生理功能，还与各种上皮来源肿瘤的发生发展密切相关。然而，RGMb/Dragon在结直肠癌发生发展中的作用及其机制尚未明确。
　　本课题首先对比了正常小鼠结直肠、小肠、胃部、肝脏、脾脏及肾脏中RGMb/Dragon的表达量。RGMb/Dragon在小鼠的肾脏和小肠组织中的表达量相对较高，而在小鼠结直肠组织中表达相对较低。在构建的炎症相关性结直肠癌(CAC)小鼠模型中，RGMb/Dragon在结直肠肿瘤组织中的表达量与正常结直肠组织相比显著上调。其次，在结直肠癌患者的手术标本中分别提取蛋白和RNA并检测了RGMb/Dragon的表达量，与正常组织相比，其在肿瘤组织中，尤其在进展期结直肠癌组织中的表达显著上调。再次，构建了过表达及干扰RGMb/Dragon的肠癌细胞和小鼠皮下移植瘤模型，并分别通过体内及体外实验证明RGMb/Dragon具有促进肠癌细胞增殖的作用，该效应主要通过调控Smad1/5/8和Erk1/2磷酸化实现。此外，配体沉默实验及小鼠中和抗体实验证明，RGMb/Dragon促进肠癌增殖作用还依赖于其配体BMP2/4的介导。
　　进展期结直肠癌面临诸多挑战，其中之一便是肿瘤对化疗药物产生耐药性。因此，本课题还进一步探讨RGMb/Dragon与结直肠癌对抗肿瘤药物奥沙利铂耐药之间关系的研究。体外实验表明，稳定表达RGMb/Dragon能够降低肠癌细胞对奥沙利铂的敏感性，提高肠癌细胞的生存率。通过构建奥沙利铂治疗皮下肠癌细胞移植瘤的小鼠模型证明，RGMb/Dragon诱导小鼠皮下肠癌移植瘤对奥沙利铂产生耐药。RGMb/Dragon削弱奥沙利铂介导的JNK和p38 MAPK激活，及Caspase-3和PARP的剪切，从而抑制奥沙利铂诱导的肠癌细胞凋亡。
　　综上，本课题研究结果揭示，排斥导向分子RGMb/Dragon是一种与肿瘤相关的新基因，它可以通过BMP通路促进结直肠癌进展，同时也是介导结直肠癌耐药的关键因子之一。RGMb/Dragon有望成为结直肠癌筛查诊断标志物及分子治疗的新靶点。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 结直肠癌研究进展

1．1．1 结直肠肿瘤的发生发展过程：从息肉到腺癌

1．1．2 结直肠肿瘤的致癌机制

1．1．3 结直肠肿瘤中信号通路的改变

1．1．4 结直肠肿瘤筛查及诊疗新思路

1．2 RGMb／Dragon与排斥导向分子家族

1．2．1 排斥导向分子家族简介

1．2．2 RGMb／Dragon

1．3 结直肠癌中的RGM家族与BMP信号通路

1．3．1 BMP信号通路与Smad信号分子

1．3．2 RGMb／Dragon相关BMP信号通路

1．3．3 BMP通路与肠道肿瘤的发生发展

第二章 材料与方法

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 细胞株

2．1．2 实验小鼠

2．1．3 结直肠癌患者组织标本及伦理申明

2．1．4 质粒载体

2．1．5 细胞培养及细胞实验相关试剂

2．1．6 核酸及蛋白实验相关试剂

2．1．7 相关抗体

2．1．8 相关引物序列

2．1．9 其他相关试剂

2．2 实验仪器与设备

2．2．1 细胞培养相关仪器设备

2．2．2 其他相关仪器设备

2．3 实验方法

2．3．1 检测RGMb／Dragon的表达

2．3．2 构建稳定干扰RGMb／Dragon的肠癌细胞株

2．3．3 构建稳定表达RGMb／Dragon的肠癌细胞系

2．3．4 细胞生物学实验

2．3．5 动物实验

2．3．6 统计学分析

第三章 结果与讨论

3．1 RGMb／Dragon在结直肠癌组织中的表达检测

3．1．1 RGMb／Dragon在结肠癌组织中表达量上调

3．1．2 讨论

3．2 RGMb／Dragon是促进结直肠癌发生发展的新型基因

3．2．1 RGMb／Dragon促进肠癌细胞增殖

3．2．2 RGMb／Dragon激活Smad1／5／8和Erk1／2磷酸化促进肠癌细胞增殖

3．2．3 RGMb／Dragon促进肠癌细胞增殖依赖于BMP4

3．2．4 讨论

3．3 RGMb／Dragon介导结直肠癌对抗肿瘤药物耐药

3．3．1 RGMb／Dragon介导结直肠癌对抗肿瘤药物奥沙利铂耐药

3．3．2 RGMb／Dragon抑制奥沙利铂诱导的细胞凋亡

3．3．3 RGMb／Dragon抑制奥沙利铂激活JNK和p38 MAPK

3．3．4 讨论

第四章 结论与展望

附录

参考文献

在学期间发表的论文

致谢