ENO1在神经胶质瘤细胞系中的功能及机制

摘要

神经胶质瘤是一种发生在脑和脊髓的胶质细胞癌变的肿瘤。胶质瘤占脑和中枢系统肿瘤的30％，占脑恶性肿瘤的80％，年发病率约为3-8人/10万人口。ENO1是糖酵解中催化磷酸烯醇式丙酮酸和磷酸甘油酸相互转化的限速酶，在多种肿瘤中，ENO1表达水平均上调。
　　本研究通过对以WBP2为诱饵的pull-down/MS结果分析得到ENO1为可能与WBP2相互作用的蛋白质。体外表达并纯化了ENO1蛋白质，并通过Pull-down实验证实了ENO1和WBP2间存在相互作用，即二者能够在体外结合。在过表达WBP2的神经胶质细胞瘤U251细胞系中，ENO1的mRNA水平亦升高，而ENO1的蛋白质也升高。在WBP2表达下调的神经胶质细胞瘤U251细胞系中，ENO1的mRNA水平亦降低， ENO1的蛋白质也降低。MTT、Transwell、划痕实验结果表明在ENO1表达下调的情况下，神经胶质瘤细胞系U251的增殖、侵袭和迁移能力均降低。流式细胞仪分析表明，在下调ENO1表达的情况下，处于G1期的细胞数量增多，S期及G2/M期细胞数量均减少。DAPI和Annexin-Ⅴ双染的细胞凋亡检测表明在ENO1表达下调的情况下，晚期凋亡的细胞数目增多，坏死细胞数量亦明显上升，而活细胞数目减少，说明ENO1表达水平下调能够促进U251细胞凋亡。
　　在下调ENO1的蛋白表达水平后，迁移相关蛋白N-cadherin表达量降低，而E-cadherin表达量上调。而细胞信号通路蛋白Erk1/2、p38等蛋白质磷酸化水平均降低。表明ENO1可能通过MAPK通路调控神经胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。这为神经胶质瘤的深入研究提供了分子生物学依据。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 神经胶质瘤概述

1．1．1 神经胶质瘤概述

1．2 WBP2在肿瘤中的研究简介

1．2．1 WBP2概述

1．2．2 WBP2研究现状

1．3 ENO1研究概述

1．3．1 ENO1研究概述

1．3．2 ENO1的功能及与疾病的关系概述

1．4 研究的目的和意义

1．4．1 研究的目的与意义

第二章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 细胞株、质粒、siRNA与引物

2．1．2 主要试剂

2．1．3 主要仪器

2．2 方法

2．2．1 常用试剂配置

2．2．2 RNA提取

2．2．3 以RNA为模板进行cDNA第一链合成

2．2．4 扩增ENO1 CDS区片段

2．2．5 琼脂糖凝胶电泳

2．2．6 凝胶回收PCR目的产物

2．2．7 感受态细胞制备

2．2．8 载体连接反应

2．2．9 转化

2．2．10 抗生素平板筛选阳性克隆

2．2．11 菌液PCR验证阳性克隆

2．2．12 菌种保存

2．2．13 质粒小提

2．2．14 双酶切

2．2．15 胶回收双酶切后目的片段

2．2．16 靶基因与表达载体连接

2．2．17 再次转化与扩增

2．2．18 重组蛋白诱导表达

2．2．1 9 重组蛋白SDS-PAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色

2．2．20 GST标签WBP2融合蛋白纯化(实验室已构建好质粒)

2．2．21 his标签ENO1融合蛋白纯化

2．2．22 重组蛋白纯化检测

2．2．23 细胞培养

2．2．24 细胞总蛋白提取

2．2．25 GST-pull down实验

2．2．26 银染

2．2．27 质粒中提

2．2．28 DNA转染U251细胞

2．2．29 siRNA稀释

2．2．30 siRNA转染U251细胞

2．2．31 G418筛选稳定转染细胞系

2．2．32 细胞冻存

2．2．33 细胞复苏

2．2．34 Western-blot

2．2．35 荧光定量PCR

2．2．36 细胞周期检测

2．2．37 划痕检测

2．2．38 Transwell检测

2．2．39 MTT

2．2．40 细胞凋亡

2．3 数据统计

2．4 本文的研究思路

第三章 结果分析与讨论

3．1 Pull-down／MS发现潜在相互作用蛋白质

3．2 体外克隆、表达并纯化ENO1

3．3 ENO1能够与WBP2在体外结合及WBP2对ENO1的影响

3．4 干扰ENO1后对细胞增殖、迁移的影响

3．5 干扰ENO1后，对细胞周期和细胞凋亡的影响

3．6 在过表达WBP2的U251细胞中下调ENO1对增殖和迁移的影响

3．7 ENO1对神经胶质瘤细胞增殖、迁移、凋亡影响的分子机制

第四章 总结和展望

4．1 总结

4．2 展望

参考文献

硕士期间参与的研究项目和成果

致谢