巴茱合剂对5xFAD转基因小鼠β-淀粉样蛋白(Aβ)生成相关机制的影响研究

摘要

目的:巴茱合剂是本人硕士导师治疗阿尔兹海默病(AD)的经验方，前期临床研究证明，巴茱合剂能有效缓解AD患者认知功能障碍，但对巴茱合剂的作用机制尚未深入研究。本文旨在通过AD转基因动物再次验证巴茱合剂的治疗效果，并进一步探索巴茱合剂治疗AD的相关分子生物学机制。
　　方法:(1)选取新型APP/PS1转基因小鼠(5xFAD小鼠)作为实验对象。将3月龄5xFAD小鼠随机分为模型组(5xFAD-Control)、巴茱合剂低剂量组(5xFAD-BZD-L)、中剂量组(5xFAD-BZD-M)、高剂量组(5xFAD-BZD-H)及安理申组(5xFAD-Donep);同窝出生野生型小鼠随机分为正常对照组(WT-Control)、巴茱合剂组(WT-BZD)、安理申组(WT-Donep)。每组小鼠12只。给药剂量为:5xFAD-BZD-L组，5xFAD-BZD-M组，5xFAD-BZD-组和WT-BZD组分别给予巴茱合剂4.225g/(kg·d)、8.450g/(kg·d)、16.900g/(kg·d)和16.900g/(kg·d);5xFAD-Donep组和WT-Donep组给予安理申0.65mg/(kg·d);5xFAD-Control组和WT-Control组给予双蒸水。各组小鼠给药12周，每日灌胃一次。
　　(2)采用行为学方法，观察巴茱合剂对5xFAD小鼠学习记忆缺陷及焦虑抑郁障碍的治疗效果。旷场实验(OFT)和高架十字迷宫(EPM)用于评价小鼠自主探究行为和焦虑抑郁状态;T/Y迷宫(T/YM)、水迷宫(MWM)和条件惊恐实验(CCFT)分别用于评价小鼠空间交替记忆力、方位定向学习记忆力和环境关联记忆力等认知能力。
　　(3)采用分子生物学方法，探索巴茱合剂是否干预β-淀粉样蛋白生成的相关生物学标志物。与Aβ生成相关的AD机制是目前最受关注的研究焦点。神经元胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)堆积是AD的经典病理表现之一。Aβ的产生与否关系到Aβ前体蛋白(APP)的两条水解途径:一是由β-分泌酶和γ-分泌酶参与的淀粉源水解途径，二是α-分泌酶和γ-分泌酶参与的非淀粉源水解途径。除此之外，乙酰胆碱酯酶(AChE)的异常表达、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的增多及超氧化物歧化酶(SOD)活性异常也将对Aβ生成造成影响。因此，APP、α-分泌酶、β-分泌酶、γ-分泌酶以及AChE、MDA、SOD等蛋白的表达或活性对Aβ的形成至关重要。
　　结果:本实验研究结果表明，巴茱合剂对5xFAD小鼠的学习记忆功能缺陷和焦虑障碍有改善作用。在高架十字迷宫中，未给药的6月龄5xFAD小鼠出现焦虑性过低，在Y迷宫、水迷宫和条件惊恐实验中则表现出明显的学习记忆功能受损。而巴茱合剂中、高剂量能改善该小鼠焦虑性过低，并提高该小鼠在Y迷宫、水迷宫和条件惊恐实验中的认知能力(P＜0.05或者P＜0.01)。进一步的机制研究发现，巴茱合剂对5xFAD小鼠脑组织中的Aβ斑块、β-分泌酶、γ-分泌酶、AChE、MDA的表达水平和SOD的活性都有影响(P＜0.05或者P＜0.01)。巴茱合剂通过降低β-分泌酶中的BACE1、γ-分泌酶中的PS1等蛋白的表达，抑制APP的淀粉源水解途径，减轻Aβ的过度生成和聚集;以及通过抑制AchE表达、调节MDA/SOD的异常水平和活性，进一步缓解Aβ淀粉样斑的沉积。
　　结论:巴茱合剂提高5xFAD小鼠的学习记忆能力并改善其焦虑性过低的作用机制可能是通过调节各种亚细胞水平蛋白进而抑制β-淀粉样斑的生成。本文为巴茱合剂临床治疗AD提供了实验理论基础，也为中药治疗AD拓宽了思路和应用前景。

目录

声明

摘要

缩略词中英文对照表

第一章 前言

1．1 阿尔兹海默病

1．1．1 阿尔兹海默病概述

1．1．2 阿尔兹海默病病理

1．1．3 阿尔兹海默病病因及发病机制

1．1．4 β-淀粉样蛋白的产生

1．2 中医药与阿尔兹海默病

1．2．1 中医药对AD的认识与治疗经验概述

1．2．2 巴茱合剂治疗AD的前期基础

1．3 阿尔兹海默病的动物模型

1．3．1 阿尔兹海默病动物模型概述

1．3．2 5xFAD转基因小鼠

1．4 本论文研究的内容与意义

第二章 材料与方法

2．1 实验材料和仪器设备

2．1．1 中药、西药、抗体和化学试剂

2．1．2 实验动物及给药方法

2．1．3 主要试剂与溶液的配制

2．1．4 主要实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 中药和西药的制备

2．2．2 小鼠基因型鉴定

2．2．3 小鼠行为学测试

2．2．4 免疫组化

2．2．5 蛋白免疫印记(western blot)

2．2．6 丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性检测

2．2．7 数据统计

第三章 实验结果及分析

3．1 5xFAD小鼠基因型鉴定

3．2 巴茱合剂提高5xFAD小鼠认知能力及改善焦虑性过低

3．2．1 巴茱合剂改善5xFAD小鼠焦虑性过低的精神障碍

3．2．2 巴茱合剂提高5xFAD小鼠学习记忆能力

3．3 巴茱合剂降低5xFAD小鼠β-淀粉样蛋白的沉积

3．4 巴茱合剂对5xFAD小鼠Aβ产生相关蛋白有影响

3．5 巴茱合剂对5xFAD小鼠胆碱能相关酶及氧化应激反应有影响

第四章 讨论与展望

4．1 巴茱合剂等中药治疗AD的思路和前景

4．2 巴茱合剂影响5xFAD小鼠行为学的效果评价

4．3 巴茱合剂干预5xFAD小鼠Aβ生成相关机制的效果评价

4．4 实验小鼠选择及实验设计思路

4．5 本实验的研究结论

4．6 本实验存在的不足和展望

参考文献

致谢

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