枇杷叶中靶向调控核受体Nur77抗糖尿病成分的分离

摘要

本课题组前期筛选研究发现含有多种三萜酸类成分的枇杷叶提取物具有靶向调节孤儿核受体Nur77抗糖尿病的潜力。我们在前期研究工作的基础上，指向性地分离筛选枇杷叶中靶向调控Nur77并具有抗糖尿病作用的三萜酸类成分。实验中，我们首先将枇杷叶乙醇提取物的正丁醇萃取分层经大孔树脂吸附色谱、硅胶正相和ODS反相柱层析细分，再用HPLC液相制备的方法分离纯化得到四种三萜酸类化合物，经1HNMR、13CNMR、DEPT等波谱分析手段及参考文献对照鉴定，确定四种化合物分别为科罗索酸(CA)、乌索酸(UA)、齐墩果酸(OA)和山楂酸(MA)。接着我们采用双荧光素酶报告基因分析技术检测分离的化合物对Nur77的转录激活作用，结果发现科罗索酸、乌索酸及齐墩果酸在报告基因系统中均能结合并影响Nur77的转录激活，其中科罗索酸能显著地激活Nur77，乌索酸的激活作用弱于科罗索酸，然而齐墩果酸却表现出一定的抑制激活的作用。进一步的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白质印迹(Western Blot)实验表明，在肝和脂肪细胞中，不论是在mRNA还是在蛋白质水平，科罗索酸均浓度依赖地上调Nur77的表达。此外，蛋白质印迹实验还表明科罗索酸在上调Nur77表达的同时下调ACC(乙酰辅酶A羧化酶)mRNA的表达，促进了ACC的蛋白磷酸化，从而抑制了ACC的作用，说明科罗索酸可能具有失活ACC，减少体内脂肪堆积的作用。干扰Nur77基因表达发现，科罗索酸失去促进ACC磷酸化的作用，因此说明科罗索酸对ACC、P-ACC的调控可能是依赖于Nur77的。为了进一步探讨科罗索酸降血糖作用与Nur77之间的关系，我们观察了科罗索酸对核受体Nur77基因敲除型小鼠糖尿病模型的影响，结果在糖尿病小鼠的葡萄糖耐量测试中，100mg/kg体重给药剂量的科罗索酸给药1周对野生型小鼠表现出糖耐量改善的趋势，而在Nur77基因敲除的小鼠表现不明显，表明科罗索酸对糖尿病小鼠的降血糖作用在一定程度上可能与Nur77存在依赖关系。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 糖尿病及相关药物研究概况

1．1．1 糖尿病概况

1．1．2 糖尿病的治疗方法

1．2 孤儿核受体Nur77的概况

1．2．1 核受体(NR)的定义及家族种类

1．2．2 Nur77家族及其结构

1．2．3 Nur77与糖脂代谢

1．2．4 Nur77与糖尿病

1．3 ACC的概况

1．3．1 ACC编码基因与磷酸化

1．3．2 ACC的生物学效应

1．4 枇杷叶研究简介

1．4．1 枇杷叶的背景介绍

1．4．2 枇杷叶的有效成分

1．4．3 枇杷叶抗糖尿病国内外研究概况

1．4．4 科罗索酸的研究概况

第二章 枇杷叶中三萜类化合物的提取与分离

2．1 实验试剂、材料和仪器

2．1．1 实验试剂

2．1．2 填料

2．1．3 实验原材料

2．1．4 实验仪器

2．2 实验方法

2．2．1 三萜类化合物的提取与分离

2．2．2 色谱条件

2．3 结果与分析

第三章 三萜类化合物在细胞水平调控Nur77抗糖尿病相关作用的细胞实验

3．1 实验试剂及仪置

3．1．1 实验试剂

3．1．2 主要溶液

3．1．3 实验仪器

3．2 试验方法

3．2．1 细胞的培养

3．2．2 Western blotting

3．2．3 RT-PCR

3．2．4 双荧光素酶报告基因

3．3 结果与讨论

3．3．1 基于Nur77对枇杷叶中单体化合物评估

3．3．2 科罗索酸对Nut77的上调是呈浓度依赖性的

3．3．3 科罗索酸对Nur77的上调是呈时间相关性的

3．3．4 科罗索酸对ACC、P-ACC的调控可能是依赖于Nur77的

第四章 科罗索酸对Nur77核受体KO型小鼠糖尿病模型的影响

4．1 小鼠基因型测定

4．2 实验材料

4．2．1 实验动物及饲料

4．2．2 实验药品和试剂

4．2．3 实验仪器

4．3 小鼠糖尿病模型的建立

4．4 给药方法

4．5 IPGTT试验

4．6 部分组织器官的取样和处理

4．6．1 小鼠的处死

4．6．2 小鼠的剖检方法

4．6．3 组织器官的称重与保存

4．7 结果与讨论

第五章 结论

致谢

参考文献