切断单侧角膜神经对于双侧角膜上皮屏障功能的影响

摘要

目的:正常的角膜上皮屏障具有维持眼表内环境稳态，保护角膜免受外来侵袭的功能。目前已知眼外伤、炎症、代谢紊乱、局部用药等因素会引起角膜上皮表层细胞连接蛋白分布及表达量改变，进而导致上皮屏障功能破坏。屏障功能障碍是多种眼表疾病发生、发展的病理学基础。角膜神经也被证实与角膜上皮之间存在着相互沟通和联系。本研究拟探讨切断单侧角膜神经后，双侧上皮屏障功能的变化，并揭示出现这种变化的可能作用机制。
　　方法:将正常的wistar大鼠随机分成3组即:空白对照组，环钻处理组，划“×”组，每组30只。分组后，空白对照组不做处理。环钻处理组使用3.00mm带芯环钻从角膜上皮向基质钻入，深度为角膜基质层2/3，对侧眼不做处理。划“×”组用刀片在角膜上划直径为3.00mm的两条相互垂直的线段，同样的对侧眼不做处理。处理后的第1天、7天、14天，做如下临床指标检测:1.角膜知觉测量，2.角膜荧光素钠染色，3.泪液分泌实验。用苏木素伊红(HE)染色观察角膜上皮细胞层的形态学变化。免疫荧光染色观察紧密连接标记物ZO-1，粘着连接标记物E-cadherin以及细胞增殖标记物Ki67的分布和表达。TUNEL试剂盒检测角膜上皮细胞凋亡的情况。Western blot和Real-time PCR技术检测角膜上皮ZO-1的蛋白和mRNA表达水平。Real-time PCR检测角膜的P物质(substance P，SP)、神经肽-1受体（neurokinin-1 receptor，NK-1R）、白介素-1β(interleukins-1β，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、血管内皮生长因子-a(vascular endothelial growth factor-a,VEGF-a)的mRNA表达。
　　结果:环钻切断大鼠单侧角膜神经后，与空白对照组相比，环钻组和环钻对侧组的角膜知觉、泪液分泌下降，角膜荧光素钠染色评分升高。处理后各组的角膜上皮细胞形态无明显变化。角膜神经免疫荧光染色结果显示，环钻切断角膜神经后，环钻组角膜上皮神经密度降低，环钻切入的角膜中央区域2周后无神经分布。环钻对侧组的角膜上皮神经密度也降低。环钻组、环钻对侧组的角膜上皮ZO-1、E-cadherin的形态与分布错乱结构不完整，ZO-1的蛋白与mRNA的表达量下调。在环钻组与环钻对侧组中，增殖和凋亡的细胞处于活跃的状态。环钻组与环钻对侧组角膜的P物质及其受体NK-1R的mRNA表达水平在处理后升高，同时炎症因子IL-1β、TNF-α、VEGF-a的mRNA表达水平都有所升高。划“×”组的ZO-1和E-cadherin的分布在处理后第1天排列不整齐，P物质、NK-1R、IL-1β、VEGF-a的mRNA表达量在处理后第1天表达上调，在第7、14天与对照组相比无显著变化。划“×”处理眼的对侧组在上述的观察指标中与对照组相比均无明显变化。
　　结论:切断单侧的角膜神经后，出现双侧角膜上皮屏障功能的破坏。同时我们发现，角膜神经破坏后双侧角膜中P物质、NK-1R和炎症因子的表达量也上调。切断角膜神经引起的角膜上皮屏障功能破坏，可能由于P物质及炎症因子表达上调所致。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 角膜的组织结构和生理功能

1．1．1 角膜的组织结构

1．1．2 角膜神经

1．1．3 角膜的生理功能

1．2 角膜上皮屏障功能的研究现状

1．2．1 参与构成角膜上皮屏障的主要蛋白及其功能

1．2．2 角膜上皮屏障功能的检测方法

1．2．3 引起角膜上皮屏障功能破坏的常见原因

1．2．4 促进角膜上皮屏障功能恢复的药物

1．3 P物质的结构、分布和功能

1．3．1 P物质的结构和分布

1．3．2 P物质在全身的作用

1．4 角膜神经与角膜上皮之间的功能联系

1．5 单侧角膜神经病变与双侧角膜疾病的关系

1．6 课题背景

第二章 实验材料与方法

2．1 实验动物

2．2 主要实验试剂

2．2．1 化学试剂

2．2．2 常用抗体

2．2．3 实验仪器设备

2．2．4 引物及其配制

2．3 常用试剂的配置方法

2．3．1 组织染色相关溶液

2．3．2 蛋白质抽提及电泳相关溶液

2．3．3 其他溶液

2．4 实验方法

2．4．1 实验动物分组和处理

2．4．2 实验过程

2．4．3 临床指标检测

2．4．4 石蜡切片的制备

2．4．5 苏木素-伊红染色(HE染色)

2．4．6 Whole mount免疫荧光

2．4．7 Western Blot免疫印迹分析

2．4．8 TUNEL凋亡试剂盒检测

2．4．9 mRNA的提取、逆转录与Real-time PCR

2．5 统计学分析

第三章 实验结果

3．1 处理后角膜上皮荧光素钠染色图

3．2 临床实验指标检测

3．2．1 角膜知觉

3．2．2 角膜荧光素钠染色评分

3．2．3 泪液分泌

3．3 苏木素伊红(HE)染色

3．4 处理后角膜神经的变化

3．4．1 处理后第1天角膜神经变化

3．4．2 处理后第7天角膜神经变化

3．4．3 处理后第14天角膜神经变化

3．4．4 处理后角膜上皮神经分布密度分析

3．5 处理后对角膜上皮屏障功能的影响

3．5．1 中央角膜上皮ZO-1的分布情况

3．5．2 中央角膜上皮E-cadherin的分布情况

3．5．3 中央角膜上皮肌动蛋白骨架的分布情况

3．6 角膜上皮基底层细胞增殖的表达变化情况

3．7 角膜上皮层细胞凋亡的表达变化情况

3．8 角膜上皮ZO-1的表达变化情况

3．8．1 角膜上皮ZO-1的蛋白表达量

3．8．2 角膜上皮ZO-1的mRNA表达量

3．9 中央角膜上皮P物质表达变化情况

3．10 P物质的mRNA表达量变化

3．11 NK-1R的mRNA表达量变化

3．12 角膜炎症因子表达变化

3．12．1 IL-1β的mRNA表达变化情况

3．12．2 TNF-α的mRNA表达变化情况

3．12．3 VEGF-a的mRNA表达变化情况

第四章 讨论

4．1 环钻处理后角膜神经的变化

4．2 切断角膜神经后常见临床指标的变化

4．3 切断单侧角膜神经后角膜上皮屏障的变化

4．4 切断单侧角膜神经后角膜上皮细胞的增殖和凋亡变化

4．5 切断单侧角膜神经后角膜P物质的表达

4．6 切断单侧角膜神经后角膜NK-1R的表达变化

4．7 切断单侧角膜神经后角膜炎症因子的变化

第五章 全文总结

参考文献

致谢

硕士在读期间科研成果