99mTc标记TSPO新型配体(CB86)在肺癌与炎症中的显像研究

摘要

目的：
　　肿瘤曾经被定义为一种和心血管病、糖尿病或者慢性呼吸系统疾病等相似的非传染性疾病。尽管它们被认为是随着患者年龄的增大、都市化的不断发展以及不健康的生活习惯而逐渐出现的，人们也慢慢认识到炎症也是导致癌症发病的重要环节之一。很多研究已经证实，炎症是一个明确可以导致肿瘤的危险因子，即伴随着人体内炎症因子的增加，C反应蛋白水平的升高，肿瘤的危险因素也在增高。炎症的环境可能是导致各种癌症发生的重要原因。如慢性乙肝及丙肝，或肝吸虫病等可增加肝癌风险;又例如空气中的刺激性物质，如石棉，PM2.5等，可显著增加胸膜间皮瘤或者肺癌的风险。故而炎症的发生发展和肿瘤的一些致病因素密切相关。
　　而近几十年来，肺癌的发病率与死亡率在世界上多数国家均呈急速上升趋势，是导致死亡的最常见癌症，特别是在欧美某些国家和我国大城市中。肺癌患者大多数为男性，男女之比为3∶1～5∶1，但近年来女性肺癌的发病率也呈明显增加趋势，肺癌已成为全球肿瘤相关性死亡的首要原因。故本文主要选取肺癌与炎症来进行初步研究。在肺癌方面，目前治疗其最佳方法为手术，但手术后的生存率仍较低，特别是随着人口老龄化速度的加快和生存环境的改变，肺癌对人口的发病和致死率的影响日益显现。早期发现、早期诊断、正确分期和合理治疗对于延长肺癌患者的寿命、改善其生存质量十分重要。因此，寻找新的药物靶标，开发新的诊断肿瘤及抗癌药物具有极其深远的作用。然而现在世界上很多肿瘤和炎症的检出主要依赖于传统影像学，但是传统影像学对其显像却受到各种条件的限制，而且在大多数情况下二者的显像结果比较相似，从而造成了混淆。这也要求找到一种可以将肿瘤和炎症区分开来的新探针，其对于临床上鉴别两者同样具有深远的意义。TSPO(转位蛋白，18kDa)被称为外周苯二氮卓类受体，主要分布在细胞的线粒体外膜中，在很多肿瘤细胞和炎症细胞中均具有高表达。在TSPO配体方面，除了PK11195，Ro5-4864等是其经典配体但具有局限性之外，CB86作为其新型配体近年来愈发受人重视。因CB86可以特异性结合细胞中的TSPO蛋白，其亲和力约为PK11195的10倍，并且可以利用较遍及的放射性核素99mTc标记CB86从而在较便宜、普及的SPECT/CT下对肿瘤及炎症模型进行显像，故CB86被认为是一种具有很大前景且可以显像的前体。因肺癌已居全球各类肿瘤恶性程度的首位，故本文主要研究TSPO在肺癌细胞与炎症细胞上的表达及99mTc标记其配体CB86在肺癌模型与炎症模型显像中的初步区别。
　　方法：
　　首先通过Western blot、流式细胞术观察TSPO抗体与正常支气管上皮细胞16HBe、肺癌细胞A549、NCI-H446的结合能力及在这些细胞中TSPO蛋白表达量的情况;细胞免疫荧光及化学染色实验检测TSPO蛋白的特异性及其在细胞质中的定位;免疫组织化学实验检测蛋白的特异性及其在肺癌组织上的表达情况;Micro-SPECT/CT显像实验观察该探针在荷瘤裸鼠中的显像效果;脂水分配系数实验检测所标记化合物是否具有脂溶性或是水溶性;体外稳定性检测所标记化合物在生理盐水及小鼠血清中的稳定性;细胞摄取与释放实验检测该探针与细胞中蛋白的结合及外排情况;炎症小鼠模型生物体内分布实验检测探针在体内各器官的摄取与滞留情况;Micro-SPECT/CT显像实验观察该探针在炎症小鼠中的显像效果。
　　结果：
　　Western blot、流式细胞术结果显示TSPO蛋白在正常支气管上皮细胞和不同肺癌细胞株中均表达，但表达量不同。细胞免疫荧光及免疫化学染色实验表明TSPO定位在细胞质。脂水分配实验结果表明99mTc-CB86是水溶性的。体外稳定性实验表明，该标记物在小鼠血清和生理盐水中放置4h后依然没有放射性分解，证明体外稳定性很好。细胞摄取和释放实验说明，其在巨噬细胞中特异性结合很高，并且在4h后缓慢从细胞中排出。生物分布实验数据发现它对巨噬细胞具有特异性摄取和良好的滞留能力。对裸鼠肿瘤模型和小鼠炎症模型进行Micro-SPECT/CT显像研究，可以看出该标记物在肿瘤模型上不摄取而在炎症上摄取清晰可见。
　　结论：
　　1.TSPO抗体可以结合正常肺细胞、肺癌细胞及组织以及巨噬细胞上TSPO蛋白，且这些细胞（正常肺细胞除外）上高表达TSPO。
　　2.我们成功制备了99mTc-CB86分子探针，99mTc-CB86的标记方法简单可行，标记率较高，稳定性较好，具有良好的TSPO蛋白靶向性及特异性，是一个具有前景的新型炎症诊断的显像剂。

目录

声明

摘要

前言

一、肺癌概述

1 肺癌的发病原因与机制

2 肺癌的治疗

二、炎症概述

三、肺癌与炎症的显像

1 肺癌的显像

2 炎症的显像

四、TSPO概述

1 外周型苯二氮卓受体的结构

2 外周型苯二氮卓受体的分布

3 外周型苯二氮受体的功能

4 TSPO配体及相关蛋白

5 TSPO在机体应激状态下的表达

6 TSPO在肿瘤中的表达

7 TSPO在炎症中的表达

8 TSPO在肺癌和炎症中的研究进展

9 研究目的和内容

第一章 TSPO在肺癌细胞株及肺癌组织中的表达

一、材料和方法

1 材料

2 方法

二、结果与分析

1 Western blotting

2 流式细胞术

3 细胞免疫化学染色

4 细胞免疫荧光染色

5 HE常规染色

6 免疫组织化学染色

7 99mTc-CB86在荷瘤裸鼠中的显像

三、讨论

第二章 99mTc-CB86的性质及其在炎症模型上的显像

一、材料和方法

1 材料

2 方法

二、结果与分析

1 Western blotting

2 细胞免疫荧光染色

3 HPLC分析标记物99mTc-CB86

4 测定标记物在生理盐水及小鼠血清中的稳定性

5 测定脂水分配系数

6 细胞摄取和释放实验

7 99mTc-CB86在炎症Balb／c小鼠中的体内分布

8 99mTc-CB86在炎症Balb／c小鼠中的显像

三、讨论

结论

本文存在的问题及今后应开展的研究

参考文献

致谢

研究生在学期间发表的主要学术论文目录