纳米银对斑马鱼卵母细胞成熟的影响

摘要

纳米材料是指三维空间中至少有一维处于纳米尺度范围(1-100nm)的材料，由于其特殊的物理化学性质，已被广泛用于工业领域。其中，纳米银(silver nanoparticles，AgNPs)因为具有良好的长效、广谱抗菌活性而被应用于医疗器械，家用电器，衣服，洗发水和包装袋等日常用品之中，是应用最广泛的纳米材料之一。因为AgNPs会被直接或者间接地释放到水环境中，会对水生生物以及人类健康造成潜在的威胁，因此其环境生态风险效应是近年来的研究热点。目前关于AgNPs对水生生物影响的研究，主要集中在浮游植物、藻类、鱼类的胚胎发育和幼鱼，而有关其对成鱼的生殖生理的影响研究相对较少。
　　鱼类卵母细胞发育到完全生长期后，孕激素(17α，20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one，DHP)可诱导其最终成熟，即生发泡破裂（germinal vesicle breakdown，GVBD）。该过程可在体外诱导实现，且成熟后的卵母细胞会变得透明，因此是一种很好的研究脊椎动物卵母细胞成熟的实验模型。本实验以斑马鱼（Danio rerio）的卵母细胞为研究对象，通过体外培养的方式，再结合形态学、生物化学和分子生物学等技术手段，研究了AgNPs对斑马鱼卵母细胞成熟的影响。为了明确AgNPs所引起的作用是来自其本身，还是其缓慢释放出的银离子（Ag+），我们同时研究了硝酸银(AgNO3)对卵母细胞成熟的影响。研究结果首次发现AgNPs会诱导卵母细胞的成熟，并深入研究了其成熟的机制。主要研究结果如下:
　　1.斑马鱼卵母细胞用AgNPs和AgNO3暴露4 hours(hr)后不但没有抑制由DHP诱发的GVBD过程，反而能诱发GVBD。在10mg/L AgNPs和1mg/L AgNO3浓度下，AgNPs和AgNO3所引起的GVBD率分别为56.10±5.41％和40.50±6.56％，这与10ng/mL DHP引起的GVBD率（66.67±4.17％）相当，且均显著(p＜0.05)高于对照（7.25±1.46％）。但随着AgNPs和AgNO3浓度升高，卵母细胞的畸形率会上升。
　　2.由于卵母细胞内环磷酸腺苷(cAMP)浓度的降低是启动卵母细胞发生GVBD的一个重要因素，我们进一步检测AgNPs和AgNO3暴露后对卵母细胞cAMP浓度的变化的影响。结果表明，30mg/L AgNPs和10mg/L AgNO3暴露2hr后，卵母细胞（尚未出现GVBD）内cAMP浓度分别下降到4.50±0.60pmol/mL和3.78±0.53pmol/mL，显著低于对照组（8.96±1.73pmol/mL）(p＜0.05)，这与10ng/mL的DHP处理组（3.95±0.61pmol/mL）的作用效果相似。
　　3.由于卵母细胞内cAMP主要来自于外围的滤泡层细胞，提示AgNPs可能影响滤泡层细胞的生理状态。我们使用透射电镜(TEM)对滤泡层细胞的超微结构进行观察。经AgNPs(30mg/L)和AgNO3(10mg/L)处理4hr后，滤泡层中的颗粒细胞和鞘膜细胞都呈现不正常的细胞形态:核凝聚，胞质皱缩等。AgNO3处理组的卵母细胞线粒体还呈现肿胀，以及空泡化等细胞凋亡的特有现象。我们进一步使用检测细胞凋亡的荧光染料Hoechst33342对滤泡层细胞进行染色，发现AgNPs和AgNO3会引起滤泡层细胞出现明显的凋亡。卵母细胞经AgNPs(10mg/L)处理3hr后，滤泡层有多数细胞凋亡，经AgNPs(30mg/L)和AgNO3(10mg/L)处理1hr后，就已经有大量滤泡层细胞凋亡。
　　4.进一步检测与凋亡和氧化应激相关的基因表达发现，卵母细胞经AgNPs(10mg/L)和AgNO3(1mg/L)处理后，与凋亡相关基因caspase9和caspase3的表达水平显著上调。同样，mt2（metallothionein-2，金属硫蛋白）也在AgNPs和AgNO3处理组中显著上调。与氧化应激相关的gst2（glutathione S transferase pi2，谷胱甘肽转移酶）的表达水平只在AgNPs处理组中有显著上升。Hsp70（heat shock protein70，热休克蛋白）是最敏感的基因，卵母细胞用AgNPs和AgNO3处理后，hsp70的表达量分别被上调了5和300倍。
　　综上所述，AgNPs和Ag+能诱导卵母细胞的成熟过程。其作用机理主要是通过引起卵母细胞外围的滤泡层细胞凋亡，间接引起卵母细胞内的cAMP浓度下降，最终引起卵母细胞出现GVBD。基因表达结果显示，AgNPs和Ag+引起滤泡层凋亡的机制存在少许差异。因此，AgNPs和Ag+引起滤泡细胞凋亡的细胞内通路有可能不同，仍需要进一步的研究来阐明。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 绪论

1．1 纳米银(AgNPs)对水生生物影响的研究进展

1．1．1 AgNPs的应用

1．1．2 AgNPs对水生生物的影响

1．1．3 纳米材料对脊椎动物配子的毒理影响

1．1．4 AgNPs的毒性机制

1．2 鱼类卵子的发生过程

1．2．1 卵母细胞发育和成熟

1．2．2 斑马鱼卵母细胞的成熟

1．3 本研究的目的和意义

第二章 AgNPs和AgNO3对斑马鱼卵母细胞成熟的影响

2．1 实验材料

2．1．1 药品试剂

2．1．2 实验仪器设备

2．1．3 溶液配制

2．1．4 AgNPs

2．1．5 斑马鱼的卵泡获取

2．2 方法

2．3 结果

2．3．1 AgNPs的粒径和浓度

2．3．2 体外卵母细胞培养实验结果

2．4 讨论

第三章 AgNPs和AgNO3诱导卵母细胞成熟的机制

3．1 实验材料

3．1．1 药品试剂

3．1．2 实验仪器设备

3．1．3 溶液配制

3．1．4 AgNPs

3．1．5 斑马鱼的卵泡获取

3．2 方法

3．2．1 cAMP测量

3．2．2 透射电镜(TEM)观察

3．2．3 Hoechst33342染色

3．2．4 基因表达分析

3．3 结果

3．3．1 AgNPs和Ag+对卵母细胞成熟过程中cAMP浓度的影响

3．3．2 AgNPs和Ag+对卵母细胞滤泡层超微结构的影响

3．3．3 AgNPs和Ag+对滤泡层细胞的凋亡影响

3．3．4 AgNPs和Ag+对滤泡层基因表达的影响

3．4 讨论

第四章 结论与展望

4．1 结论

4．2 展望

4．3 创新

参考文献

在学期间参加的科研项目及成果

致谢