紫檀茋对体外培养星形胶质细胞氧化应激损伤的保护作用及机制

摘要

研究背景:脑卒中是目前全世界范围内危害人类生命健康的主要疾病，其中急性缺血性脑卒中是最常见的卒中类型，目前仍然缺少有效的治疗药物。因此探讨脑缺血损伤的机制，并寻找相应的治疗药物，对减轻脑缺血引起的损伤和提高人类的生存质量具有极其重要的意义。近些年来，氧化应激学说在缺血性脑血管疾病中的地位日益提升，倍受关注。星形胶质细胞在脑内发挥抗氧化应激和营养支持神经元等重要作用，在脑内的数量是神经元的数倍，是中枢神经系统的重要组成部分，并且在中枢神经系统的生理和病理过程中发挥着不可忽视的作用。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)是一种配体激活的核转录因子，可调节包括超氧化物岐化酶(superoxidedismutase，SOD)和过氧化氢酶(catalase，CAT)在内的多种蛋白的表达，可减轻机体的氧化应激损伤。紫檀芪(pterostilbene，Pte)是主要存在于蓝莓中的茋类化合物，课题组前期研究表明Pte可对抗小鼠脑缺血后脑内氧化应激损伤。
　　目的:观察Pte对星形胶质细胞氧化应激损伤的作用，并从PPARα信号通路的角度探讨Pte对星形胶质细胞氧化应激损伤的作用机制。
　　方法:体外培养C6星形胶质细胞系，应用过氧化氢诱导氧化应激损伤模型，或体外原代培养小鼠大脑皮质星形胶质细胞，应用缺糖缺氧(OGD)模拟脑缺血后脑氧化应激损伤模型。Pte(1～10μM)预保护6h，MTS法测定细胞的活力，PI/hoechst法观察细胞坏死和凋亡情况，DCFH荧光探针法测定细胞内活性氧自由基，蛋白免疫印迹法测定星形胶质细胞结构蛋白GFAP，功能蛋白BDNF的表达，及抗氧化通路相关蛋白PPARα，SOD和CAT的表达。并应用PPARα拮抗剂MK886，或应用PPARα敲除小鼠原代培养的大脑皮层星形胶质细胞，研究Pte抗氧化应激损伤作用是否与其激动PPARα相关。
　　结果:Pte可减轻C6或原代培养小鼠星形胶质细胞氧化应激损伤，上调PPARα，及抗氧化酶SOD，CAT的表达。MK886或PPARα表达缺失可阻断Pte的保护作用。
　　结论:Pte通过激活PPARα介导的抗氧化信号通路，对抗星形胶质细胞氧化应激损伤。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 氧化应激与脑缺血损伤

1．1．1 自由基与氧化应激

1．1．2 脑缺血损伤与氧化应激

1．2 星形胶质细胞与氧化应激

1．2．1 星形胶质细胞的分类与功能

1．2．2 星形胶质细胞在脑缺血损伤中的变化及作用

1．3 过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα)

1．3．1 PPARα简介

1．3．2 PPARα与氧化应激

1．3．3 PPARα与神经保护

1．4 紫檀芪(Pterostilbene，Pte)

1．4．1 紫檀茋概述

1．4．2 紫檀茋的抗氧化作用及其机制

1．4．3 紫檀茋与中枢神经系统损伤

第二章 体外星形胶质细胞氧化应激损伤模型建立

2．1 实验材料

2．1．1 主要实验仪器及试剂

2．1．2 主要试剂的配制

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养和细胞处理方法

2．2．2 MTS检测细胞活力

2．2．3 细胞释放LDH检测

2．2．4 细胞内ROS检测

2．2．5 细胞内蛋白表达检测

2．2．6 统计学处理

2．3 实验结果

2．3．1 不同浓度H2O2对C6细胞活力的影响

2．3．2 H2O2处理后恢复不同时间对C6细胞活力的影响

2．3．3 不同浓度H2O2对C6细胞内ROS生成的影响

2．3．4 H2O2损伤后恢复不同时间对C6细胞内ROS生成的影响

2．3．5 H2O2对C6细胞内GFAP和BDNF表达的影响

2．4 本章小结

第三章 Pte对过氧化氢诱导的C6星形胶质细胞氧化应激损伤的作用

3．1 实验材料

3．1．1 主要实验仪器及试剂

3．1．2 主要试剂的配制

3．2 实验方法

3．2．1 细胞处理方法

3．2．2 细胞形态学观察

3．2．3 细胞MTS、LDH、ROS检测方法

3．2．4 细胞凋亡染色

3．2．5 坏死细胞染色

3．2．6 统计学处理

3．3 实验结果

3．3．1 Pte对H2O2引起的C6细胞氧化应激损伤的影响

3．3．2 Pte对H2O2诱导的C6细胞内ROS生成的影响

3．3．3 Pte对H2O2诱导的C6细胞凋亡的影响

3．3．4 Pte对H2O2诱导的C6细胞坏死的影响

3．4 本章小结

第四章 从PPARα信号角度探讨Pte对过氧化氢诱导的C6细胞氧化应激损伤的作用机制

4．1 实验材料

4．1．1．主要实验仪器及试剂

4．1．2 主要试剂的配制

4．2 实验方法

4．2．1 C6细胞预处理

4．2．2 细胞MTS、LDH、ROS检测方法

4．2．3 细胞免疫荧光染色

4．2．4 细胞内蛋白表达检测

4．2．5 统计学处理

4．3 实验结果

4．3．1 PPARα及其下游抗氧化酶在H2O2诱导的C6细胞氧化应激损伤中的表达变化

4．3．2 Pte对H2O2诱导的C6细胞氧化应激损伤后PPARα及其下游抗氧化酶蛋白表达的影响

4．3．3 MK886可减弱Pte对H2O2引起的C6细胞氧化应激损伤的保护作用

4．3．4 MK886可部分阻断Pte对C6细胞氧化应激后PPARa通路相关蛋白表达的上调作用

4．4 本章小结

第五章 Pte对缺糖缺氧(OGD)诱导的原代星形胶质细胞氧化应激损伤作用和机制

5．1 实验材料

5．1．1 主要实验仪器及试剂

5．1．2 主要试剂的配制

5．2 实验方法

5．2．1 原代星形胶质细胞提取分离、纯化和鉴定

5．2．2 Pte对OGD诱导的原代星形胶质细胞氧化应激损伤的作用

5．2．3 统计学处理

5．3 实验结果

5．3．1 小鼠大脑皮层星形胶质细胞形态学观察及细胞免疫荧光化学染色鉴定结果

5．3．2 Pte对原代星形胶质细胞OGD后细胞活力的影响

5．3．3 Pte对OGD损伤后原代星形胶质细胞PPARα通路相关蛋白表达影响

5．3．4 Pte对抗OGD诱导的损伤作用依赖PPARα

5．4 本章小结

第六章 结论与展望

缩略语表

参考文献

科研成果

致谢