SKAP2在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的作用

摘要

哺乳动物的卵母细胞需要经历两轮连续性的不对称细胞分裂才能最后产生一个单倍体卵子用于后续的受精，卵母细胞的不对称分裂是用以保证绝大部分的母源细胞质存留于卵母细胞中为随后的早期胚胎发育提供必要的营养物质。在这两次分裂中，纺锤体必须精确组装才能保证同源染色体和姐妹染色单体分别在第一次减数分裂和第二次减数分裂中分离。染色体的精确分离保证了遗传物质的正确分配，在这个过程中出现的任何错误都将直接导致非整倍体的发生或发育畸形。而卵母细胞减数第一次分裂进行的不对称分裂对卵母细胞的成熟与否至关重要。本文以小鼠卵母细胞为研究模型，研究了SKAP2在减数第一次不对称分裂关键细胞事件中所发挥的作用。
　　Src kinase-associated phosphoprotein2(SKAP2)是酪氨酸家族激酶的作用底物，它通过调控微丝的重组装进而可以影响细胞的迁移、微绒毛的形成等过程。然而，关于SKAP2的研究主要都集中在体细胞方面，在我们的研究中，我们检测了它在小鼠卵母细胞减数分裂过程中的形态学定位和生物学功能。免疫荧光的结果显示，SKAP2在第一次减数分裂中期，后期和第二次减数分裂中期都与微丝存在空间定位上的联系。我们接下来用微丝聚合抑制剂细胞松弛素(CB)处理，结果进一步显示SKAP2与微丝存在空间上的联系。为了研究SKAP2的生物学功能，我们采用了siRNA注射的方法下调SKAP2的表达，并发现SKAP2下调后导致小鼠卵母细胞不对称的胞质分裂，也导致了大极体排放率的上升。同时我们进一步发现SKAP2的下调影响微丝帽的正常形成，同时SKAP2的下调干扰了第一次减数分裂中期纺锤体的迁移。总而言之，我们的实验数据证明SKAP2可能通过影响纺锤体的迁移来调节小鼠卵母细胞成熟的不对称胞质分裂。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 引言

1．2 纺锤体迁移的调控机制

1．2．1 微丝是调控小鼠卵母细胞MI纺锤体迁移的核心蛋白

1．2．2 参与调控MI纺锤体迁移和小鼠卵母细胞极性及不对称分裂的激酶和小G蛋白

1．3 细胞皮质极性的建立

1．4 极体的排放：皮质膜突起和肌动球蛋白环收缩协同完成的结果

1．5 纺锤体检验点系统

1．6 SKAP2参与小鼠卵母细胞不对称胞质分裂的调控机制

1．7 总结与展望

第二章 材料方法

2．1 实验动物

2．2 药品与试剂

2．3 主要的仪器

2．4 卵母细胞的采集与培养

2．5 细胞松弛素处理

2．6 实时定量聚合酶链式反应

2．6．1 卵母细胞总RNA的提取

2．6．2 总RNA的逆转录PCR反应

2．6．3 Real time qPCR反应

2．7 显微注射针的制作与siRNA显微注射术

2．7．1 注射针、固定针的制作

2．7．2 siRNA显微注射术

2．8 免疫荧光和激光共聚焦显微术

2．9 聚丙烯酰胺凝胶电泳(western blotting)

2．9．1 制蛋白胶

2．9．2 细胞样品的准备

2．9．3 上样

2．9．5 转膜

2．9．6 封闭

2．9．7 孵育抗体

2．9．8 显影

2．10 统计学分析

第三章 结果

3．1 SKAP2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的亚细胞定位

3．2 SKAP2与微丝在小鼠卵母细胞减数分裂过程中共定位

3．3 下调SKAP2功能引起卵母细胞的不均等分裂的失败

3．4 下调SKAP2功能引起纺锤体的异常中心定位

3．5 下调SKAP2功能影响胞质分裂和细胞的周期进程

3．6 下调SKAP2功能使微丝帽无法正常形成

第四章 讨论

第五章 结论

致谢

参考文献