自噬在角膜上皮空气暴露损伤中的作用及机制研究

摘要

目的：探讨自噬在角膜上皮细胞空气暴露损伤中的作用及内在机制。
　　方法：以人角膜上皮细胞系和C57BL/6小鼠建立角膜空气暴露损伤模型。透射电子显微镜检测损伤过程中细胞结构的变化;免疫荧光染色、免疫印迹和实时荧光定量PCR等方法检测损伤过程中自噬相关基因以及炎症相关因子的表达变化;TUNEL染色检测细胞凋亡的发生。
　　结果：透射电子显微镜观察到空气暴露培养的HCE细胞中自噬泡的存在。进一步通过免疫荧光染色和免疫印迹等检测方法证实随着空气暴露培养时间的延长，细胞中LC3(LC3Ⅱ)表达显著增强。TUNEL染色显示加入氯喹和3-MA等自噬抑制剂能够明显增加空气暴露培养中的HCE细胞的凋亡比率。在小鼠角膜暴露损伤模型中，暴露处理前期角膜中自噬水平逐渐增加，此时角膜中凋亡细胞数量同步增加。通过腹腔注射3-MA后小鼠角膜上皮凋亡细胞明显增加，而自噬激活剂组较对照组减少。提示自噬能够在一定程度上抑制小鼠暴露损伤模型中角膜上皮细胞的凋亡。免疫印记检测结果显示p-AKT含量持续减少并且p-p38表达明显增加，表明在暴露损伤模型可能通过AKT和p38通路共同调节下游mTOR相关信号通路以影响自噬，促进角膜上皮细胞的存活。
　　结论：空气暴露损伤可诱导角膜上皮发生自噬，自噬在一定程度上有利于维持眼表微环境，促进角膜上皮细胞存活。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 自噬

1．1．1 自噬概述

1．1．2 自噬的研究历史

1．1．3 mTOR信号通路与自噬

1．1．4 p38／MAPK介导的应激与自噬

1．2 自噬与眼部疾病

1．2．1 角膜中的自噬

1．2．2 晶状体中的自噬

1．2．3 RPE中的自噬

1．2．4 光感受器中的自噬

1．3 泪膜稳定与空气暴露损伤

第二章 实验材料

2．1 主要抗体

2．2 试剂和药品

2．3 主要实验仪器和耗材

2．4 试剂配制

2．4．1 细胞培养相关试剂的配制

2．4．2 石蜡标本与切片制备相关试剂的配制

2．4．3 免疫荧光染色相关试剂的配制

2．4．4 蛋白免疫印迹相关试剂的配制

2．4．5 透射电子显徽镜相关试剂的配制

2．4．6 TUNEL染色相关试剂的配制

2．4．7 自噬抑制剂、激活剂等相关溶液的配制

2．5 主要应用软件

2．6 实验动物

第三章 实验方法

3．1 人角膜t皮细胞系的空气暴露培养

3．2 小鼠空气暴露损伤模型的建立与活体观察

3．2．1 小鼠空气暴露损伤模型的建立

3．2．2 小鼠角膜荧光素钠染色

3．3．石蜡标本与切片的制备

3．3．1 石蜡标本的制备

3．3．2 石蜡切片的制备

3．4 石蜡切片的脱蜡与复水

3．5 免疫荧光染色

3．6 实时荧光PCR

3．6．1 总RNA的提取

3．6．2 反转录PCR(RT-PCR)

3．6．3 实时荧光定量PCR

3．7 蛋白免疫印迹(Western Blotting，WB)

3．7．1 细胞、组织蛋白的提取

3．7．2 蛋白样品的定量与制备

3．7．3 SDS-PAGE凝胶的制备

3．7．4 SDS-PAGE电泳

3．7．5 转膜

3．7．6 免疫反应与显影

3．8 透射电子显微镜

3．8．1 取材和固定

3．9 TUNEL染色

3．9．1 细胞的TUNEL染色

3．9．2 石蜡组织切片的TUNEL染色

3．10 统计学分析

第四章 结果与分析

4．1 空气暴露培养对人角膜上皮细胞系的影响

4．1．1 透射电子显微镜观察HCE细胞内超微结构的变化

4．1．2 空气暴露培养的HCE细胞中自噬相关蛋白的变化

4．1．3 自噬对空气暴露培养的HCE细胞凋亡的影响

4．2 小鼠角膜暴露损伤模型的建立

4．3 小鼠暴露损伤模型与自噬

4．3．1 小鼠暴露损伤模型中的自噬

4．3．2 自噬对小鼠空气暴露损伤中的角膜上皮细胞凋亡影响

4．4 空气暴露损伤模型诱导自噬的相关通路研究

第五章 讨论

5．1 空气暴露损伤可诱导角膜上皮细胞中的自噬

5．2 自噬对角膜上皮细胞的保护作用

5．3 自噬在角膜上皮疾病中的潜在应用价值

第六章 结论

参考文献

致谢

附录

在学期间的主要科研成果