MAPK信号通路参与调控苯并(a)芘和滴滴涕联合暴露致DNA损伤的机制研究

摘要

目的：
　　苯并(a)芘(benzo[a]pyrene，BaP)是多环芳烃类化合物的典型代表之一，于各种环境介质中广泛存在，具有很强的致癌性，被国际癌症研究机构列为1类致癌物。滴滴涕(2，2-bis(4-chlorophenyl)-1，1，1-trichloroethane，DDT)曾是生产及使用范围最广的一类有机氯农药，在环境中非常难于降解，具有高亲脂性，可以对哺乳动物的肝脏、肾脏、神经等系统造成损害。BaP和DDT常共存于环境并可通过食物链的生物放大作用富集于人体，危害人类健康。因此，探讨二者联合暴露对机体的毒性效应及机制，不仅可以揭示二者联合效应的作用模式，更为评估多种污染物联合暴露的生态安全性提供科学依据，具较好的理论价值和现实意义。
　　方法:
　　以遗传毒理学试验研究中常用的HepG2细胞株为研究对象，以DNA损伤早期出现的组蛋白H2AX磷酸化焦点γH2AX(gamma-H2AX)的形成为效应指标，设0.1％二甲基亚砜(DMSO)为溶剂对照组，12.5、25、50μmol/L BaP和0.1、1、10μmol/L DDT为处理组。单独暴露组为上述浓度的BaP或DDT分别作用24h;联合暴露组为0.1、1或10μmol/L的DDT处理HepG2细胞24h后，再分别加入12.5、25或50μmol/L的BaP作用24h。采用免疫荧光及westernblot法分析单独及联合暴露组γH2AX焦点及蛋白的表达量，明确二者联合作用的毒效应类型。针对具有明确联合毒效应的组别:采用western blot法检测磷酸化蛋白p-p38、p-ERK和p-JNK的表达，揭示丝裂原活化蛋白激酶家族(mitogen-activated protein kinase，MAPK)的三条经典信号通路:c-jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)通路、细胞外信号调节激酶(extracelluar signal-regulated kinase，ERK)通路和/或P38MAPK通路的活化情况;采用细胞色素P4501A(cytochromeP4501A，CYP4501A)抑制剂α-萘黄酮(α-Naphthoflavone，ANF)预处理1h后，检测γH2AX、CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1蛋白的表达，找到参与BaP和DDT联合暴露致DNA损伤效应的CYPP450酶;采用MAPK通路抑制剂SB203580和PD98059处理30min后，检测γH2AX、CYP1A1、CYP1A2和CYP1B1蛋白的表达，探讨BaP和DDT联合暴露致HepG2细胞DNA损伤的MAPK信号通路调控机制。
　　结果:
　　(1) BaP和DDT单独诱导DNA损伤的剂量效应关系:BaP和DDT均可诱导HepG2细胞产生γH2AX。与溶剂对照组相比，BaP处理组随着染毒剂量升高(12.5、25、50μmol/L)，γH2AX表达量增高，差异有统计学意义(P＜0.05)。DDT处理组未发现剂量效应关系。
　　(2) BaP和DDT联合诱导DNA损伤的效应类型:免疫荧光结果经2因素3水平析因设计方差分析得出:BaP和DDT间存在联合效应(F=5.070，P＜0.001)。其中，具有协同作用的组为:0.1μmol/L DDT+12.5μmol/L BaP;具有拮抗作用的组为:0.1μmol/L DDT+50μmo l/L BaP、10μmol/L DDT+25μmol/L BaP、10μmol/L DDT+50μmol/L BaP。western blot结果经2因素3水平析因设计方差分析得出，BaP和DDT间存在联合效应(F=13.279，P＜0.001)。其中，具有协同作用的组为:10μmol/L DDT+12.5μmol/L BaP;具有拮抗作用的组为:0.1μmol/L DDT+25μmol/L BaP、1μmol/L DDT+25μmol/L BaP、0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP、1μmol/L DDT+50μmol/L BaP。因此，确定具有拮抗作用的0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP联合暴露组进行后续研究。
　　(3) CYP450酶参与BaP和DDT联合暴露的DNA损伤效应:与溶剂对照组相比，50μmol/L BaP可以诱导HepG2细胞CYP1A1、CYP1A2、CYP1B1和γH2AX表达量升高，加入ANF处理后，CYP1A1、CYP1A2和γH2AX表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。0.1μmol/L DDT可以诱导HepG2细胞 CYP1A1、CYP1B1和γH2AX表达量升高，加入ANF处理后，CYP1A1、CYP1B1和γH2AX表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP可以诱导HepG2细胞CYP1A1、CYP1A2和γH2AX表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。加入ANF处理后，与0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP相比，CYP1A1、1A2、γH2AX表达量降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　(4) MAPK通路参与调控CYP450酶介导的BaP和DDT联合暴露致DNA损伤:与对照组相比，50μmol/L BaP诱导HepG2中p-p38、p-JNK、p-ERK表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05);0.1μmol/L DDT诱导HepG2中p-p38和p-JNK表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05);0.1μmol/L DDT+50μmol/L诱导HepG2中p-p38和p-ERK表达量升高，差异有统计学意义(P＜0.05)。与0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP组相比，SB203580、PD98059处理后CYP1A1、CYP1A2和γH2AX蛋白表达量降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　(1) BaP和DDT均可诱导HepG2细胞产生γH2AX，且BaP诱导的γH2AX表达量随着浓度的升高而升高;DDT组未发现剂量效应关系。
　　(2) BaP和DDT联合暴露致HepG2的细胞DNA损伤类型既可以表现为协同作用，也可以表现为拮抗作用。其中，免疫荧光和western blot结果均显示0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP联合暴露组为拮抗作用。
　　(3) CYP1A1和CYP1A2参与50μmol/L BaP致HepG2细胞的DNA损伤过程。CYP1A1和CYP1B1参与0.1μmol/L DDT致HepG2细胞的DNA损伤过程。CYP1A1和CYP1A2参与0.1μmol/L DDT+50μmol/L BaP致HepG2细胞的DNA损伤过程。
　　(4) P38MAPK和ERK信号通路参与调控CYP1A2介导的0.1μmol/LDDT+50μmol/L BaP联合暴露致HepG2的DNA损伤。

目录

声明

摘要

英文缩略词语汇表

前言

第一部分 BaP和DDT联合暴露致HepG2细胞的DNA损伤

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 HepG2细胞生长状况

2．2 BaP-DDT对HepG2细胞增殖的抑制

2．3 BaP和DDT诱导DNA损伤的免疫荧光结果

2．4 BaP和DDT诱导DNA损伤的蛋白表达情况

2．5 BaP和DDT联合暴露诱导DNA损伤的效应类型

3 讨论

4 结论

第二部分 BaP和DDT联合暴露致DNA损伤的机制研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 CYP450酶参与BaP和DDT联合暴露的DNA损伤效应

2．2 BaP和DDT联合暴露诱导MAPK通路活化

2．3 MAPK通路参与调控CYP450酶介导的BaP和DDT联合暴露致DNA损伤

3 讨论

4 结论

总结与展望

综述

参考文献

在学期间成果

致谢