脂质过氧化致新生开睑大鼠角膜缘干细胞缺乏的机理研究

摘要

角膜(cornea)是眼睛前端的一层透明组织，角膜上皮(cornealepithelium)位于角膜的最外层，传统观点上认为角膜上皮的自我更新能力主要依赖于角膜缘干细胞，角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)可导致角膜混浊、结膜化、血管化和视力下降。多种因素可导致角膜缘干细胞缺乏，但目前角膜缘干细胞缺乏的发病机制尚未明确。脂类代谢(lipidmetabolism)是机体的重要的三大代谢之一，过氧化物酶体增殖物激活受体alpha(peroxisome proliferators-activated receptor alpha，PPARα)在脂代谢中发挥着重要作用，非诺贝特（fenofibrate，Fen）是PPARα的激动剂，可以促进脂肪酸β氧化。脂类代谢异常可导致脂质过氧化(lipid peroxidation)，对机体造成损伤。
　　目的:利用新生大鼠强行开睑（forcing-eye-open-at-birth，FEOB）角膜缘干细胞缺乏模型，研究脂类代谢和脂质过氧化在LSCD病变中的变化和影响，探讨脂类代谢和角膜缘干细胞缺乏的关系。
　　方法:本课题实验分为两个部分，第一部分为研究角膜脂类代谢和脂质过氧化在角膜缘干细胞缺乏病变过程中的变化，其实验大鼠随机分为正常对照组和FEOB实验组两个组，每组按出生天数分为P0、P1、P5、P10、P15、P30，每组15只;第二部分实验采用非诺贝特处理FEOB大鼠角膜10天，观察其对FEOB角膜缘干细胞缺乏是否有治疗作用，本实验共分为3组:Normal组、(FEOB+PBS)组和(FEOB+Fen)组，每组大鼠15只。实验采用裂隙灯检查，HE染色和PAS染色观察其组织病理学形态;采用油红O染色检测角膜表面的中性游离脂肪酸;实时荧光定量逆转录-聚合酶链式反应(Real-timefluorescent quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blotting)检测LSC的标志物(P63、ABCG2)、脂类代谢相关因子[PPARα、肉碱棕榈酰基转移酶(carnitine palmitoyltransferase1alpha，Cpt1)、脂酰辅酶A合酶(long chain acyl-CoA synthetase，Acsl)、脂酰辅酶A脱氢酶(medium chain acyl-CoA dehydrogenase，Acadm)、烯酰辅酶A水合酶(short chain enoyl-CoA hydratase，Ech)]、脂质过氧化相关因子5-脂氧合酶(5-lipoxygenase，ALOX5);采用原位杂交(in situ hybridization，ISH)检测PPARα在角膜的定位，采用免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)的方法检测炎症细胞的标记物(ED1、PMN);采用试剂盒检测丙二醛(malonaldehyde，MDA)的含量和超氧岐化酶(superoxide dismutase，SOD)的活性。
　　结果:第一部分:与正常大鼠相比，在发育过程中，FEOB大鼠角膜角膜透明性降低，出现新生血管，角膜上皮细胞病理性增生、细胞排列紊乱，PAS染色阳性，LSC标志物P63、ABCG2表达下调，角膜特异性角蛋白K12表达下降，K10、K13表达上调，角膜上皮基底层PCNA阳性细胞数显著下降，符合角膜缘干细胞缺乏诊断标准;FEOB大鼠角膜表面油红O染色阳性，说明角膜表面出现脂类沉积，与此同时调控脂类代谢的核受体PPARα表达下调，脂质代谢相关酶类Cpt1α、Acsl、Acadm和Ech的表达也下调;脂质过氧化酶ALOX5表达上调，脂质过氧化产物MDA增多，表明脂类代谢异常，脂质发生过氧化;
　　第二部分:与FEOB+PBS组对照，Fenofibrate处理FEOB大鼠后，角膜未见溃疡，新生血管数量减少，PCNA阳性细胞增多，角蛋白K12表达上调，K10、K13表达下调，说明Fenofibrate可以减轻LSCD病症;处理后油红O染色转为阴性，Fenofibrate作为PPARα的激动剂，可以激活PPARα表达，上调Cpt1α、Acsl、Acadm和Ech的表达，促进脂类β氧化;角膜中的ALOX5和ALOX5ap均表达下调，脂质过氧化的产物MDA含量下降。
　　结论:新生大鼠开睑之后，角膜微环境发生改变，角膜表面出现脂类沉积，同时脂类代谢相关调控因子PPARα下调，脂类β氧化被抑制，脂类代谢异常，脂质发生过氧化导致损伤，是引起角膜缘干细胞缺乏的可能关键因素;Fenofibrate通过激活PPARα，促进脂类代谢，降低脂质过氧化，是病理状态下角膜缘干细胞的新型保护剂。

目录

声明

摘要

第一章 前言

1．1 角膜缘干细胞缺乏

1．1．1 干细胞概述

1．1．2 角膜缘干细胞

1．1．3 角膜缘干细胞缺乏(limbal stem cell deficiency，LSCD)

1．1．4 角膜缘干细胞缺乏动物模型

1．2 脂类代谢

1．2．1 脂类的吸收

1．2．2 分解代谢

1．2．3 合成代谢

1．2．4 脂类代谢调控因子

1．3 脂质过氧化(lipid peroxidation)

1．4 本论文的研究目的和意义

第二章 实验材料与方法

2．1 实验材料

2．1．1 实验动物

2．1．2 主要实验试剂与耗材

2．1．3 实验仪器

2．1．4 抗体

2．1．5 引物设计

2．2 实验方法

2．2．1 实验主要溶液的配制

2．2．2 实验技术路线

2．2．3 新生大鼠的开睑手术操作

2．2．4 正常大鼠和新生开睑的裂隙灯观察

2．2．5 蛋白免疫印迹法(Western Blotting)

2．2．6 石蜡切片的制备

2．2．7 苏木素-伊红染色(HE染色)

2．2．8 PAS染色

2．2．9 TUNEL法检测细胞凋亡

2．2．10 免疫组织化学染色法

2．2．11 qRT-PCR检测基因转录水平

2．2．12 大鼠PPARα原位杂交

2．3 实验数据处理和统计学分析

第三章 结果与分析

3．1 大鼠出生后强行开睑诱发角膜缘干细胞缺乏

3．1．1 Normal和FEOB大鼠角膜发育过程

3．1．2 FEOB大鼠角膜各发育时间点P63、ABCG2的表达

3．1．3 FEOB大鼠角膜PCNA的表达

3．1．4 FEOB大鼠生长发育时间点角膜中细胞角蛋白的表达

3．2 FEOB大鼠角膜脂质代谢异常与脂质过氧化

3．2．1 新生开睑大鼠角膜上皮表面有脂类沉积

3．2．2 脂肪酸结合蛋白(FABPs)在新生开睑模型中角膜的表达

3．2．3 FEOB大鼠角膜中脂类代谢下调

3．2．4 FEOB大鼠角膜沉积的脂质发生过氧化

3．2．5 FEOB大鼠角膜各发育时间点细胞凋亡的检测

3．2．6 FEOB大鼠角膜各发育时间点ED-1、PMN免疫组化染色

3．2．7 FEOB大鼠角膜SOD2 mRNA表达和SOD酶活性

3．3 非诺贝特对FEOB角膜缘干细胞缺乏有改善作用

3．3．1 Fenofibrate对FEOB角膜病理学观察

3．3．2 Fenofibrate可提高FEOB角膜缘干细胞标记物P63、ABCG2的表达

3．3．3 Fenofibrate可以提高FEOB大鼠角膜PCNA的表达

3．3．4 Fenofibrate对FEOB角膜角蛋白K10、K12和K13表达的影响

3．3．5 Fenofibrate实验组大鼠角膜表面未见脂类沉积

3．3．6 脂肪酸结合蛋白(FABPs)的表达

3．3．7 Fenofibrate激活FEOB大鼠角膜中脂类代谢相关因子的表达

3．3．8 Fenofibrate可以抑制FEOB角膜表面的脂质过氧化

3．3．9 Fenofibrate可以抑制FEOB大鼠角膜上皮细胞凋亡

3．3．10 Fenofibrate可以减缓FEOB大鼠角膜炎症细胞浸润

3．3．11 Fenofibrate可以降低FEOB大鼠角膜SOD2的表达和SOD酶活性

第四章 讨论

第五章 总结

参考文献

附录

在学期间发表论文

致谢