人朊病毒蛋白抗病突变体G127V结构和动力学研究

摘要

人朊病毒蛋白(Human prion protein，HuPrP)的正常细胞型构象(cellular form HuPrP，HuPrPC)是由位于20号染色体上的朊病毒蛋白基因（human prion protein gene，PRNP）编码的一种内源性膜锚定蛋白。该蛋白发生病变即细胞型构象转变成瘙痒型（scrapie isoform HuPrP，HuPrPSc）后，导致人罹患朊病毒病(Prion diseases)，也称传染性海绵状脑病(Transmissible Spongiform Encephalopathies，TSEs)。该类疾病是引起中枢神经系统（central nervous system，CNS）损坏的神经退行性疾病，尤其使大脑空泡化。该类疾病在临床上可分为:克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease，CJD)、格斯特曼综合症(Gerstmann-Straussler Syndrome，GSS)、致死性家族失眠症（Fatal Familial Insomnia，FFI）和库鲁病(Kuru)。最引起人类恐慌的是CJD中的两种亚型:变异体CJD(variant CJD，vCJD)和医源性CJD（iatrogenic CJD，iCJD）。该类疾病潜伏时间长，缺乏有效的早期诊断技术，目前也没有有效的治疗药物，死亡率百分百。因而，对该类疾病的研究，一直是关乎人类健康和生命安全的重点。幸运的是，最新研究发现HuPrP的G127V点突变体，尤其是纯合子基因，对CJD和Kuru等疾病都有完全抗病能力。然而G127V突变体的抗病功能的分子机制，目前并不清楚;这一分子机制的揭示，将直接促进TSEs的诊断与治疗的发展。
　　为揭示G127V抗病突变体的分子机制，本论文运用异核多维液体核磁共振技术，解析了细胞型人朊病毒蛋白G127V突变体(片段Gln91-Ser231，下文简写为HuPrP(G127V))的溶液结构。与相同的条件下解析的野生型结构(WT HuPrP)对比，发现HuPrP(G127V)的片段Tyr128-Gly131和Val161-Arg164不能组装成β折叠片，而是形成了伸展结构（Stretch-Strands pattern，SSs）;α1螺旋与α2和α3螺旋之间距离变短，螺旋堆积更紧密;片段Leu125-Ser135和α1螺旋的表面电荷分布发生了变化。在细节上，Tyr128的侧链由野生型的β折叠片内侧翻转到外侧，改变了Tyr128与α2螺旋的相互作用;Arg164与Asp178之间距离也变短，使SSs与α2和α3螺旋之间距离更近;由于二面角psi(Tyr157)改变，Pro158的侧链发生翻转，改变了三个α螺旋所形成的空腔。这些结构上的改变，尤其是SSs的形成，阻碍了基于β折叠的prion构象转变。
　　同时也进行了核磁共振动力学分析。发现在HuPrP(G127V)中Gly131的横向弛豫速率R2很高，低频谱密度函数J(0)值也很高;Tyr163的R2和J(0)值也略偏高。CPMG弛豫扩散实验表明Gly131、Tyr163表现出μs-ms时间尺度上的慢运动，即构象化学交换。Tyr128在HuPrP(G127V)的1H-15N HSQC谱中消失，表明该氨基酸也存在构象化学交换。由于HuPrP(G127V)中三个氨基酸残基Tyr128、Gly131、Tyr163的内运动明显不同于野生型，直接阻碍了HuPrP(G127V)中的β折叠的形成，而是只能形成SSs。由于SSs中Tyr128侧链翻转的影响，α2螺旋上的相应残基Ile182和Gln186的内运动也发生了改变。此外，α3的内运动也发生了波动。所有这些内运动特性的改变，也都成为阻止基于以β折叠为基础的构象转变的关键因素。
　　此外，还进行了分子动力学模拟(Molecular dynamics simulation，MD)，发现:在0-100ns时间尺度上的MD模拟过程中，SSs稳定存在而不会转变为β折叠片;α1螺旋C末端以310螺旋形式存在;二面角psi(Tyr157)显著改变等其它结构上的变化结果也得到了支持。MD模拟还发现:Tyr128的侧链伸向SSs外侧，导致HuPrP不能形成分子间二聚体，进而阻止了HuPrP聚集和纤维化。
　　本研究工作详细地剖析了HuPrP(G127V)的溶液结构和动力学特征，阐明了影响HuPrP构象转变和分子间聚集的主要因素。这些结果为最终揭示G127V突变体的抗病机理提供了坚实的结构基础，也为朊病毒病的诊断和药物开发等提供了理论依据。

目录

声明

摘要

缩略语表

第一章 人朊病毒蛋白概述

1．1 人朊病毒蛋白和朊病毒病

1．1．1 人朊病毒蛋白

1．1．2 人朊病毒病

1．1．3 基因突变与朊病毒病

1．1．4 朊病毒蛋白导致朊病毒病的分子机制

1．2 人朊病毒蛋白的结构

1．2．1 野生型人朊病毒蛋白的结构

1．2．2 朊病毒突变体蛋白结构

1．2．3 晶体结构与构象转变假设

1．3 人朊病毒蛋白主链15N动力学研究

1．3．1 主链15N的纵向弛豫速率(R1)、横向弛豫速率(R2)和异核稳态{1H}-15N NOEs

1．3．2 约化谱密度函数映射

1．3．3 主链15N弛豫扩散实验

1．4 人朊病毒蛋白分子动力学模拟研究

1．5 本课题的研究目的和科学意义

参考文献

第二章 HuPrP(G127V)溶液结构解析

2．1 引言

2．2 材料与实验方法

2．2．1 主要材料

2．2．2 实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 13C／15N同位素标记蛋白表达纯化

2．3．2 HuPrP(G127V)的核磁共振信号指认

2．3．3 HuPrP(G127V)溶液结构测定

2．4 本章小结

参考文献

第三章 HuPrP(G127V)NMR动力学分析

3．1 引言

3．2 实验材料与方法

3．2．2 纵向弛豫、横向弛豫、异核稳态NOE

3．2．3 约化谱密度函数映射

3．2．4 CPMG弛豫扩散

3．2．5 氢／氘交换

3．3 结果与讨论

3．3．1 HuPrP(G127V)的15N标记样品制备

3．3．2 纵向弛豫、横向弛豫，异核稳态NOE

3．3．3 约化谱密度函数映射

3．3．4 CPMG弛豫扩散

3．3．5 氢／氘交换

3．4 本章小结

参考文献

第四章 HuPrP(G127V)分子动力学模拟

4．1 引言

4．2 实验方法

4．3 结果与讨论

4．3．1 HuPrP(G127V)二级结构分子动力学模拟分析

4．3．2 Tyr128侧链的分子动力学模拟分析

4．3．3 HuPrP(G127V)的二面角psi(Tyr157)和RMSD分子动力学模拟分析

4．4 本章小结

参考文献

第五章 全文总结

附录

在读期间发表的学术论文

致谢