金属硫蛋白在小鼠心脏缺血再灌注损伤中的保护作用

摘要

随着医疗技术水平的不断发展，器官移植目前已经成为心、肺、肝、肾等重要器官终末病症治疗的主要方式，并且适应范围和求量日益增加。虽然，随着人HLA配型和环孢素、他克莫斯等新型免疫抑制剂的开发与应用，器官移植后的免疫排斥反应得到了更有效的控制，大大延长了移植器官的存活期；但是，由于供体器官在移植过程中离体缺血和移植后血流复通所引起的缺血再灌注损伤，供体器官的移植存活受到了极大的限制。为了更好地提高供体器官的移植存活率，减轻供体器官缺血再灌注损伤成为了器官移植的一大研究方向。
　　心脏移植是器官移植中的重要部分，是终末期心力衰竭的有效治疗方法。心脏在移植过程中，心肌细胞处于缺氧、冷休克环境，会引发部分心肌细胞的坏死和暂时性的功能受损。而近来大量报道指出，心脏缺血再灌注损伤的主要阶段是集中在缺血后再灌注复流的这一时间段内。在心脏缺血再灌注损伤过程中，氧自由基所介导的细胞毒性反应发挥着关键作用；引发了 G蛋白、腺苷酸环化酶的功能异常以及 ATP酶活性的改变；并对血管内皮细胞、肌肉细胞和神经细胞等造成严重影响。病理表现为心肌细胞坏死、凋亡，线粒体功能障碍，脂质过氧化物增加，自由基大量生成。缺血再灌注损伤在临床上可引发复流后心脏顿抑、再灌注性心率失常和心肌坏死，并导致恶性心律失常的发生，左心室收缩力减弱、室内压下降等心肌功能减退的表现。最终，导致心脏移植存活效率并不高。如何有效地减轻心脏移植过程中的供心缺血再灌注损伤成为了研究的热点。
　　1957年，美国科学家 Margoshoes在研究金属生物学作用时，从动物器官中分离出一种镉的金属蛋白质。由于它是一种低分子量、高巯基含量、能大量结合重金属离子的金属蛋白质，因此称为金属硫蛋白（Metallothionein，简称MT），MT分子呈椭圆形，分两个结构域,分子量为6,000～8,000道尔顿,直径30～50 A,含有61个氨基酸,其中20个氨基酸为半胱氨酸，少数有21个,这样每一个MT分子就可以结合7～12个金属离子。人体、动物、植物以及微生物体内均含有MT，而且其理化特性基本一致，具有特殊的吸光性。MT构象较坚固,具有较强的耐热性。
　　MT的重要生理功能表现在它是一种目前所知的最有效的自由基清除剂，其清除自由基（·OH）的能力约为超氧化物歧化酶(SOD)的几千倍，而清除氧自由基（·O）的能力约是谷胱甘肽（GSH）的25倍，而且具有很强的抗氧化活动。MT作为一种强的内源性细胞保护蛋白，在心血管系统抗损伤保护中发挥着重要作用，主要表现在对缺血再灌注损伤的抑制作用。临床实践证明，缺血预处理能提高体内 MT含量，并通过保护氧化酶活力减轻心肌细胞缺氧/复氧所导致的心肌损伤。
　　MT目前的主要制造工艺是动物肝脏提取法，由于动物肝脏提取法提取量小、工艺复杂、成本高、产量低。这些问题严重限制了MT在临床上的研究和应用。本课题通过选取改良的九州虫草菌种，并采用生物发酵方法，生产、提取金属硫蛋白，同时利用所提取的金属硫蛋白，观察其在小鼠心脏移植过程中对冷缺血再灌注损伤的影响。本课题尝试开发一种更经济、简便、有效的金属硫蛋白生产工艺，并探讨外源性金属硫蛋白在供体心脏缺血再灌注损伤中的保护机制，不仅为金属硫蛋白在治疗供心缺血再灌注损伤方面提供了理论依据，而且为其临床应用提供了新思路。
　　第一部分九州虫草金属硫蛋白的诱导，提纯及性质研究
　　目的：以生物发酵工程为手段，探寻一种经济、高效、简便的金属硫蛋白生产工艺，并用正交试验法优选出最适的生产提取条件。
　　方法：以经过基因工程改良的九州虫草真菌为菌种,采用液态深层发酵法发酵、ZnSO4法增殖菌丝体并诱导其合成金属硫蛋白；待菌丝体成熟后经细胞破碎、粗提取和Sephadex G-50柱层析等步骤，得到锌金属硫蛋白，并通过统计分析九州虫草菌丝体金属硫蛋白的产率，得出硫酸锌诱导虫草金属硫蛋白的最佳条件。提纯后，对所提取的金属硫蛋白的相对分子质量、巯基含量及金属锌的含量等性质进行初步探究。
　　结果：相对传统的动物肝脏提取方法，九州虫草菌株发酵法可以高效、经济、快速地提取金属硫蛋白。发酵过程中培养基中锌原子的含量为15g/L是诱导金属硫蛋白生成的最适条件，最高产率可达10.86mg/g菌丝体（湿重）。该种锌金属硫蛋白分子量为7KD，每分子金属硫蛋白含有由21个半胱氨酸和7个锌原子。通过蛋白柱层析图谱，紫外光扫描图谱和肽指纹图分析，证明所提取蛋白符合金属硫蛋白的相应特征，并具有较高纯度。
　　结论：使用九州虫草菌株发酵法可经济、高效、快速地生产出符合金属硫蛋白化学特性的亚群较单一的蛋白质。
　　第二部分一种改良的小鼠颈部异位心脏移植模型的建立
　　目的：在Cuff法(“袖套”法血管吻合术)小鼠颈部异位心脏移植术的基础上，改良一种新的套管式小鼠颈部异位心脏移植模型，克服传统小鼠颈部异位心脏移植术，术程复杂，供心冷缺血时间不易控制，供心血管结扎复杂，全程冷缺血时间个体差异大等问题，通过对供心修剪工艺，套管流程等方面的改进，建立一种较传统小鼠颈部异位心脏移植模型，缺血时间更稳定，个体差异更小，术程更简易的小鼠颈部异位心脏移植模型。
　　方法：供心制备过程摒弃了体内浮冰渣停跳，全身肝素化等繁琐步骤，直接采取阻断下腔静脉阻断同时4℃肝素灌注后立即剥离供心置于冰盘上冷却停跳。并对供心肺门集束结扎，单独结扎下腔静脉后，靠近心脏根部集束结扎肺门所有组织血管。在移植过程中采用套管法吻合肺动脉与颈外静脉，主动脉与颈总动脉，同时实验了先置备供体套管后再取供心，将心脏总缺血时间降低到8分钟以内。
　　结果：模型较以往方法术程明显缩短（50±7min），供心总缺血时间最少可减少到7分47秒，降低了手术难度，供心热缺血时间小于一分钟，并使每次手术间冷缺血时间变得可控，手术稳定性大大提高，续重复 C57BL/6J小鼠同系移植20对，24小时存活率97％，14天小鼠颈部可视的有节律的心脏跳动18对，成功率90%。大大高于缝线法颈部移植和腹部移植术式。
　　结论：改良后的套管式小鼠颈部异位心脏移植模型，是一种较传统小鼠心脏移植模型稳定可靠，成功率高，且冷、热缺血时间可控的模型技术。
　　第三部分在小鼠同种同系颈部异位心脏移植模型中，金属硫蛋白对供心组织缺血再灌注损伤的保护作用
　　目的：通过在小鼠同种同系颈部异位心脏移植模型研究外源性金属硫蛋白在心脏移植中对心肌缺血再灌注损伤的保护作用，观察外源性金属硫蛋白在心肌冷缺血再灌注后对心肌细胞炎性反应和凋亡的影响，并探讨其中可能的机制。
　　方法：以C57建立异位心脏移植模型，模拟在移植过程中的心肌冷缺血再灌注损伤，并比较移植后检测血清CTnl，LDH,供体心脏内MDA含量，IL-1 BETA、IL-6、TNF-alpha、HAS-1、Caspase-3、Bax、Bcl2的RNA表达水平。检测心脏凋亡并计算凋亡指数（AI），检测F4/80标志免疫物组织化学切片。
　　结果：在小鼠同种同系心脏移植模型中，提前注射外源性金属硫蛋白的实验组与对照组对比24小时后cTnI、LDH表达明显降低（p<0.05）；移植24小时后供体心脏内IL-1β、IL-6、TNF-α、HMGB-1mRNA的相对表达水平明显下调p<0.05）；移植3天后，实验组较对照组炎性细胞侵润程度明显减小（p<0.05）。移植24小时后Caspase-3、Bax的mRNA相对表达水平也显著减低（p<0.05）；移植24小时后组织MDA含量有明显差异（p<0.05）；STAT-3蛋白表达较对照组也有减弱。
　　结论：在移植前，注入外源性金属硫蛋白可以有效减轻同种同系心脏移植模型中的缺血再灌注损伤，减少移植心脏心肌细胞中自由基含量，抑制由于缺血再灌注造成的心肌细胞炎性因子表达和细胞凋亡。

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中文摘要

第一部分 九州虫草金属硫蛋白的诱导，提纯及性质研究

1.前言

2.材料与方法

3.结果

4 讨论

5.结论

第二部分 一种改良的小鼠颈部异位心脏移植模型的建立

1.前言

2.材料与术式

3.结果

4.讨论

5.结论

第三部分 在小鼠同种同系颈部异位心脏移植模型中，金属硫蛋白对供心组织缺血再灌注损伤的保护作用

1.前言

2.材料和方法

3.结果

4.讨论

5.结论

参考文献

英文摘要

致谢

缩略词表

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附录：综述:金属硫蛋白及其在心脏缺血再灌注损伤中的作用