亚洲带绦虫六钩蚴Ta18芽孢型益生菌口服疫苗的构建与生物学特性研究

摘要

1、背景：
　　传统的分类学把人体带绦虫分为猪带绦虫（Taenia solium）和牛带绦虫（Taenia saginaia）两种。近三十年来，在东南亚和西太平洋的许多国家和地区发现了另一种新的带绦虫，其成虫特征几乎和牛带绦虫一致，而囊尾蚴又与猪带绦虫幼虫相似，寄生在中间宿主猪的体内，人因生食猪肝等内脏而感染，这种带绦虫被命名为亚洲带绦虫（Taenia asiatica）。人是以上三种带绦虫唯一的终宿主，猪和牛是其主要的中间宿主，猪带绦虫虫卵感染还可引起严重的囊尾蚴病（囊虫病）。我国北部和西部地区是带绦虫病和囊虫病较严重的流行区。研究证实在贵州的都匀地区存在亚洲带绦虫的流行，从江地区存在牛带绦虫的流行，患者主要是青壮年，对当地的劳动生产力影响很大，是危害西部欠发达地区经济社会发展的严重公共卫生问题。
　　近几年来我们在亚洲带绦虫的分类学、生态学、发育生物学、组织病理学和免疫学、基因组学等研究领域做了大量的研究，研究证实亚洲带绦虫的分类学地位是介于猪带绦虫和牛带绦虫之间的一个独立种，从分子进化的角度分析，其基因序列和蛋白质序列与猪带和牛带都有很高的同源性。因此可以推断，亚洲带绦虫的某些抗原，可作为猪带绦虫和牛带绦虫的通用抗原，可作为猪带绦虫和牛带绦虫免疫诊断和疫苗的候选抗原，利用课题组在亚洲带绦虫的地域优势和基因资源优势，发展我国的带绦虫诊断试剂盒和疫苗开发是本研究的主要目标，针对中间宿主（猪、牛）和终宿主（人）的抗感染疫苗是预防这些寄生虫病的重要策略。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为一种新型口服疫苗载体系统，具有传统口服疫苗载体不可比拟的优势：①枯草芽孢杆菌具有良好的安全性，已作为益生菌广泛应用于人及动物；②枯草芽孢杆菌耐性强，对干燥、高温、高压、氧化、及酸、碱毒物等等不良环境的抵抗力强，可在室温条件下长期储存；③枯草杆菌基因组的研究已较完善，枯草杆菌克隆技术也比较成熟；④以芽孢状态口服，枯草芽孢杆菌在排出体外之前，其在小肠有可能经过发芽、复制过程。研究表明，大部分枯草芽孢通过胃肠道后仍能存活。枯草芽孢衣壳蛋白融合表达的抗原具有很高的稳定性，能抵抗胃酸和肠道消化酶的破坏，维持蛋白稳定的构象，肠道益生菌枯草芽孢能很好保护表达在其表面的抗原，并具有强大的佐剂功能。
　　根据已知的猪、牛带绦虫六钩蚴18kD基因的序列，我们从亚洲带绦虫六钩蚴中克隆并鉴定了Ta18基因。生物信息学分析表明，该基因与牛带绦虫18kDa蛋白一致性达99％，与猪带绦虫一致性达97%，所以推断该基因为亚洲带绦虫18kDa基因，命名为Ta18基因。18kD基因被公认为是带绦虫科最具有前途的疫苗候选基因，同时，猪带绦虫TsOL18和TSOL-45及细粒棘球绦虫Eg95的重组抗原免疫保护性效果已被充分证实，这类蛋白的生物学功能未知，同源性也不高，但都有含有一个纤连蛋白III的功能域，推测该类蛋白的免疫保护性取决于构象表位而非线性表位，重组蛋白因不容易保持稳定的构象而限制其推广应用，我们利用生物信息学对 Ta18基因一级结构的功能结构域进行预测，发现其具有FnIII功能域。
　　本研究在对 Ta18基因进行生物信息学分析和克隆表达的基础上，从枯草杆菌基因组中扩增芽孢衣壳蛋白CotC，将Ta18基因克隆入CotC结构基因的下游，采用枯草原生质体转化法将重组质粒转入枯草杆菌 WB600并诱导芽孢生成，构建Pus186-CotC-Ta18重组枯草芽孢工程菌。展开对 Ta18重组枯草芽孢的生物学特性研究，分析其所产生的免疫应答特征，对其免疫保护效果进行评估，为搭建新型高效抗绦、囊虫病口服疫苗平台奠定基础。
　　2、目的和意义：
　　以分类地位介于猪带绦虫和牛带绦虫的亚洲带绦虫作为突破点，充分发挥学科交叉优势，使用枯草芽孢杆菌作为表达载体，对亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因进行原核表达，关于利用枯草芽孢表达带绦虫候选抗原基因至今未见报道，探索以芽孢型益生菌候选抗原递送系统刺激抗亚洲带绦虫虫卵感染的免疫特点，分析免疫应答类型、强度、及对攻击感染的保护效果。本项目拟从中间宿主入手，研制猪、牛用口服疫苗，切断传播途径，从而达到预防绦、囊虫病的目的。以带绦虫功能基因组学研究为基础，以新型原核表达平台为手段，以实用化应用成果为目标，利用先进的技术手段实现基础研究成果的转化。
　　3、方法：
　　3.1亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的生物信息学分析及重组枯草芽孢工程菌的构建
　　3.1.1亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因生物信息学分析
　　利用美国国家生物技术信息中心NCBI网站的BLASTx对测序所得核酸序列进行分析，用瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统（ExPASY）提供的生物信息学工具对Ta18基因所编码蛋白的功能和特性进行预测。ProtParam分析预测蛋白质的理化性质。
　　3.1.2亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达
　　鉴定亚洲带绦虫成虫，孵化虫卵，提取六钩蚴总RNA并合成cDNA，设计引物扩增六钩蚴Ta18基因，鉴定pET-28a(+)-Ta18重组质粒，诱导表达Ta18重组蛋白，大量表达并纯化，获得纯化蛋白，测定蛋白浓度。
　　3.1.3 Ta18重组蛋白抗血清制备
　　使用纯化的Ta18重组蛋白皮下注射免疫大鼠，获得Ta18特异性抗血清。
　　3.1.4 Ta18的免疫原性和免疫反应性分析
　　用制备的Ta18重组蛋白抗血清，Western Blotting方法检测Ta18重组蛋白的免疫原性及免疫反应性。
　　3.1.3亚洲带绦虫六钩蚴 Ta18重组枯草芽孢杆菌工程菌的构建
　　提取枯草杆菌基因组 DNA，设计引物扩增芽孢外壳蛋白 CotC，目的基因 CotC和Ta18与质粒 Pus186连接，转化枯草杆菌 WB600原生质体，构建并鉴定Pus186-CotC-Ta18融合表达载体，诱导芽孢生成，收集、定量芽孢，提取芽孢外壳蛋白并检测。Western Blotting方法检测Ta18重组枯草芽孢的免疫反应性。
　　3.2 Ta18重组枯草芽孢的生物学特性研究
　　3.2.1Ta18重组枯草芽孢的抗性评估
　　配置模拟胃液和肠液，调节好pH值。将离心后的菌液重悬于模拟胃、肠液中，铺板，计数。
　　3.2.2重组芽孢表面Ta18的免疫荧光、流式细胞仪检测
　　以大鼠抗Ta18重组蛋白的免疫血清为一抗，荧光标记抗大鼠IgG为二抗，检测目的蛋白在芽孢表面的表达，同时，对重组芽孢进行流式细胞仪检测。
　　3.2.3 Ta18在亚洲带绦虫的组织定位及阶段表达研究
　　以大鼠抗Ta18重组蛋白的免疫血清为一抗，以绿色荧光标记的抗大鼠IgG为二抗，检测 Ta18基因在亚洲带绦虫成虫、虫卵及囊尾蚴的组织定位，并在荧光显微镜下观察、拍照。分别以亚洲带绦虫成虫头节cDNA文库、成虫成节cDNA、成虫孕节cDNA及囊尾蚴cDNA文库为模板，用合成引物扩增，进行阶段表达分析。
　　3.3 Ta18重组枯草芽孢免疫保护性效果评估
　　3.3.1 Ta18重组枯草芽孢口服免疫家猪血清中IgG及粪便中IgA的含量变化研究
　　设Pus186-CotC-Ta18芽孢组、Pus186-CotC芽孢组及常规感染组，口服免疫家猪，定期收集血清和粪便，ELISA法检测血清中IgG及粪便中IgA的含量变化。
　　3.3.2抗Ta18多抗对亚洲带绦虫六钩蚴体外作用
　　分离亚洲带绦虫虫卵，体外孵化六钩蚴，实验分3组进行体外杀伤六钩蚴实验，统计学分析。
　　3.3.3 Ta18重组枯草芽孢口服疫苗免疫保护性效果研究
　　3.3.3.1虫卵攻击感染实验
　　分三组：重组枯草芽孢组（Pus186-CotC-Ta18）、空载体枯草芽孢组（Pus186-CotC）和常规感染组（用生理盐水处理）口服免疫家猪后，用亚洲带绦虫虫卵攻击，于30、40天，处死家猪，仔细检查家猪体内囊尾蚴寄生情况，计数虫荷。
　　3.3.4实验感染家猪肝脏的病理学变化
　　取各感染猪肝脏组织分别置于10%甲醛内固定后进行常规石蜡切片，H. E.染色,镜检。
　　4、结果：
　　4.1亚洲带绦虫六钩蚴Ta18的生物信息学分析及重组枯草芽孢工程菌的构建
　　4.1.1 Ta18基因生物信息学分析
　　生物信息学分析结果显示Ta18基因序列与GenBank中的牛带绦虫18kD蛋白的一致性达99%；与猪带绦虫一致性达97%，包含完整的开放阅读框，为全长cDNA序列，序列长度为396bp，编码131个氨基酸。预测Ta18蛋白质的理论分子量为14810.4 Da；等电点为10.05，其他理化性质均较稳定。亚细胞定位发现该基因含有一信号肽序列，蛋白翻译后结构特征预测发现在30-117位氨基酸处含有一个绦虫属18kD基因共有的纤连蛋白FnⅢ型结构域。
　　4.1.2亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达
　　成功从亚洲带绦虫六钩蚴中扩增出Ta18基因，并克隆到原核表达载体pET28a(+)上，通过双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET28a(+)-Ta18构建成功。表达重组质粒并获得纯化蛋白。Western Blotting分析结果表明，重组Ta18纯化蛋白能被重组蛋白免疫的SD大鼠血清识别，具有较好的免疫原性；同时也能被带绦虫病患者血清识别，说明重组蛋白具有免疫反应性。
　　4.1.3 Ta18重组枯草芽孢工程菌的构建
　　提取枯草杆菌基因组，设计特异性引物扩增出芽孢外壳蛋白CotC，将Ta18基因克隆入CotC结构基因的下游，构建Pus186-CotC-Ta18重组质粒，采用枯草原生质体转化方法将 Pus186-CotC-Ta18重组质粒转化入枯草杆菌 WB600，通过对阳性克隆的筛选，用耗竭法使CotC-Ta18融合表达在芽孢表面，每升DSM液体培养所生成芽孢达1×1011。重组枯草芽孢表达的融合蛋白能被制备的抗血清识别。
　　4.2 Ta18重组枯草芽孢的生物学特性研究
　　4.2.1 Ta18重组枯草芽孢的抗性评估
　　Ta18重组枯草芽孢在模拟胃、肠环境中具有较高的耐受力和存活率，表明芽孢能耐受极端环境，能顺利通过胃环境，到达肠道。
　　4.2.2 Ta18在亚洲带绦虫的组织定位及阶段表达研究
　　免疫荧光组织定位结果显示 Ta18定位于成虫的表膜、虫卵的胚膜、囊尾蚴的体壁上。来自六钩蚴的Ta18基因，在成虫的头节、成节、孕节以及囊尾蚴阶段均有表达。
　　4.2.3亚洲带绦虫六钩蚴Ta18重组枯草芽孢的免疫荧光定位及流式细胞仪检测
　　以大鼠抗Ta18重组蛋白的免疫血清为一抗，荧光标记抗大鼠（FITG标记）为二抗Pus186-CotC-Ta18重组芽孢表面可见绿色荧光。流式细胞仪检测到Ta18重组枯草芽孢（Pus186-CotC-Ta18）有强荧光峰。
　　4.3 Ta18重组枯草芽孢免疫保护性效果评估
　　4.3.1 Ta18重组枯草芽孢口服免疫家猪血清中IgG及粪便中IgA的含量变化研究
　　粪便中特异性IgA水平显著高于非重组芽孢处理组及常规感染组，但血清IgG升高不明显。
　　4.3.2抗Ta18多抗对亚洲带绦虫六钩蚴体外作用
　　体外培养4d后，抗Ta18多抗与对照组比较，杀虫率差异显著（P<0.05）。
　　4.3.3 Ta18重组枯草芽孢口服疫苗免疫保护性效果研究
　　4.3.3.1虫卵攻击感染实验
　　在虫卵攻击后的第30、40天，可观察到常规感染组和Pus186-CotC组家猪肝脏上囊尾蚴数量明显多于Pus186-CotC-Ta18组，减虫率可达到75.4%。
　　4.3.4感染家猪肝脏的病理学变化
　　囊尾蚴周围的肝细胞可见水肿,空泡变性，组织内较多嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，囊尾蚴周围组织表现为肉芽肿性炎。Ta18重组芽孢免疫组、CotC芽孢免疫组与常规感染组囊尾蚴所致家猪肝脏病理变化未见明显差异。
　　5、结论：
　　5.1首次根据已知的猪、牛带绦虫六钩蚴18kD基因序列克隆出亚洲带绦虫六钩蚴18kD基因。生物信息学预测显示Ta18包含完整的开放阅读框，序列长度为396bp，编码131个氨基酸。有一信号肽序列和纤连蛋白FnⅢ型功能结构域。
　　5.2对Ta18基因进行克隆表达，获得纯化蛋白。重组Ta18纯化蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性，可以作为潜在的疫苗候选分子。但不适合作为特异的绦、囊虫病诊断抗原。
　　5.3 Ta18定位于成虫的表膜、虫卵的胚膜和囊尾蚴的体壁上。Ta18在亚洲带绦虫卵、成虫的头节、成节、孕节以及囊尾蚴阶段均有表达。进一步证明了 Ta18基因是疫苗候选分子。
　　5.4成功构建 Pus186-CotC-Ta18重组枯草芽孢工程菌，采用枯草原生质体转化法将Pus186-CotC-Ta18重组质粒转化入枯草杆菌WB600，免疫荧光定位及流式细胞仪检测结果显示CotC-Ta18融合表达在芽孢表面。
　　5.5枯草芽孢在模拟胃、肠环境中具有较高的耐受力和存活率。
　　5.6免疫保护性效果研究显示：1）、体外杀伤实验证实抗Ta18血清中存在针对六钩蚴的保护性抗体；2）、重组芽孢口服免疫家猪，粪便特异性IgA水平显著高于对照组，血清IgG也有升高，但变化不明显，说明重组枯草芽孢能发挥免疫佐剂作用，活化肠粘膜上的相关淋巴组织，使SIgA抗体分泌增强；3）、Ta18重组枯草芽孢的减虫率达到75.4%，重组芽孢能对家猪产生明显的保护性免疫；4）实验感染家猪肝脏，囊尾蚴寄生周围的肝细胞可见水肿,空泡变性，组织内较多嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞浸润，并伴肉芽肿形成。

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封面

目录

中文摘要

英文摘要

前言

技 术 路 线

第一部分 亚洲带绦虫六钩蚴 Ta18 基因的生物信息学分析及重组枯草芽孢工程菌的构建

第一节 亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因生物信息学分析

第二节 亚洲带绦虫六钩蚴Ta18基因的克隆、表达

第三节 亚洲带绦虫六钩蚴Ta18重组枯草芽孢工程菌的构建

第一部分 结论

第二部分 亚洲带绦虫Ta18重组枯草芽孢的生物学特性研究

第一节 亚洲带绦虫Ta18重组枯草芽孢的抗性评估

第二节 Ta18抗原在亚洲带绦虫的组织定位及阶段表达研究

第三节 亚洲带绦虫六钩蚴Ta18重组枯草芽孢的免疫荧光定位及流式细胞仪检测

第二部分 结论

第三部分 Ta18抗原重组枯草芽孢口服免疫的保护性效果评估

第一节Ta18抗原重组枯草芽孢口服免疫家猪血清中IgG及粪便中IgA的含量变化研究

第二节 亚洲带绦虫六钩蚴Ta18重组枯草芽孢工程菌免疫保护效果研究

第三节 亚洲带绦虫感染家猪肝脏的病理学变化分析

第三部分 结论

全文综合讨论

全文结论

参考文献

本研究的特色与创新点

博士在读期间以第一作者发表的学术研究论文

博士在读期间主持的研究课题

博士在读期间获奖情况

博士在读期间参加学术会议等情况

2006年至今在人体带绦虫研究领域主持的课题

主要中英文缩略词表

声明

致谢

综述一: 枯草芽孢杆菌疫苗在肠道黏膜免疫中的研究进展

综述二: 后基因时代的带绦虫研究

附录