家蝇内源性纤维素酶的检测及组织分布和表达差异研究

摘要

目的：检测家蝇纤维素酶活性，研究家蝇内源性β-1,4-葡萄糖苷酶(β-1,4-glucosidase，BG)的组织分布和表达差异，以证实家蝇具有分泌内源性纤维素酶的功能，了解家蝇利用植物纤维的方式，从而为制定新的家蝇生态控制措施提供科学依据，达到降低家蝇传播疾病的危害和保护生态环境的目的。
　　方法:（1）通过DNS法检测家蝇3龄幼虫纤维素水解活性，并分别测定BG酶，内切β-1,4-葡聚糖酶(endo-β-1,4 glucanase，EG)和外切β-1,4-葡聚糖酶(exo-β-1,4-glucanase，CBH)的活性。在体视显微镜下分离家蝇3龄幼虫唾液腺及肠道各部分组织，测定各组织器官的纤维素酶活性和酶系构成。初步分析家蝇纤维素酶的最适反应时间，最适反应温度和热稳定性等酶学特性。（2）制作家蝇3龄幼虫整虫石蜡切片，通过组织学常规苏木精-伊红染色（hematoxylin-eosin staining，HEstaining)结合过碘酸-希夫氏染色（periodic acid-schiffstaining，PAS staining)观察家蝇3龄幼虫的组织结构。（3）用RNA原位杂交、反转录PCR、免疫组织化学法定位产生家蝇BG酶的组织器官。（4）用DNS法测定家蝇BG酶的活性，实时荧光定量PCR法检测家蝇BG酶mRNA的表达水平，分析3龄幼虫产BG酶的各器官BG酶的表达差异；不同发育时期家蝇BG酶的表达差异；不同粗纤维含量饲料条件下（实验组1和实验组2）家蝇BG酶的表达差异，设常规麦麸饲养组为对照组。
　　结果:（1）家蝇3龄幼虫具有降解滤纸为单糖的能力，滤纸酶活性为(2.30±0.034)IU/mg，其纤维素酶系的组成包括BG、EG和CBH酶，酶活性依次为(1.34±0.032)IU/mg、(1.84±0.055)IU/mg和(2.96±0.056)IU/mg。家蝇3龄幼虫唾液腺、前肠、中肠、后肠以及剩余组织均具有BG、EG和CBH3种纤维素酶活性，各组织的纤维素酶活性有显著差异（P<0.05），酶活性水平高低依次为中肠>剩余组织>唾液腺>前肠>后肠。在pH5.6的条件下，家蝇纤维素酶系3种酶的最适反应温度和时间分别为50℃和60 min，在体外具有较强的热稳定性，50℃放置1 h后仍可保持较强的酶活性。（2）成功制作家蝇3龄幼虫整虫石蜡切片，Carnoy固定液或加入TritonX-100的多聚甲醛固定液都适合家蝇3龄幼虫的固定，固定后切除部分体壁组织是保证脱水和包埋成功的关键。HE染色结合PSA染色清楚地显示了家蝇3龄幼虫消化系统、中枢神经系统、排泄系统、血细胞、呼吸系统、体壁、肌肉和脂肪体的组织结构，在骨骼肌纤维、体壁的表皮细胞和脂肪体细胞的胞质中均见糖原颗粒，在中肠和马氏管上皮腔面有纹状缘分布。（3）家蝇3龄幼虫石蜡切片RNA原位杂交显示，家蝇BG酶mRNA定位于消化系统的唾液腺、前肠和中肠上皮细胞的胞质中，后肠无家蝇 BG酶mRNA分布。除此以外，在幼虫非消化系统的部分组织器官，马氏管、气管和体壁的上皮细胞中也有家蝇BG酶mRNA的分布。反转录PCR与原位杂交实验结果一致，在家蝇幼虫唾液腺，前肠，中肠、马氏管、气管及体壁均有 BG酶mRNA表达，而在后肠和脂肪体未见表达。免疫组织化学染色结果显示，家蝇纤维素酶的分布与原位杂交结果基本一致，进一步证实了上述结果。（4）家蝇BG酶mRNA在家蝇中肠和唾液腺的表达量最高，中肠的表达量约为前肠的4.92倍，唾液腺的表达量约为前肠的2.99倍，马氏管的表达量约为前肠的1.63倍，体壁的表达量约为前肠的1.19倍，气管的表达量最低，仅为前肠的0.77倍，差异有统计学意义（P<0.05）。家蝇3龄幼虫各组织BG酶活性高低顺序依次为：中肠>唾液腺>马氏管>体壁>前肠>后肠>气管，与BG酶mRNA相对表达量高低顺序基本一致。这些组织的BG酶活性的差异有统计学意义（P<0.05）。（5）家蝇在发育的不同时期，BG酶 mRNA表达量及酶活性均随家蝇的发育逐渐增高（P<0.05），卵期的酶活性和mRNA表达量皆最低，幼虫和蛹依次增高，而成虫的最高。成虫期BG酶mRNA表达量较卵期上调了22.0±3.0倍，而酶活性较卵期提高了26.67±2.08倍。（6）测得对照组饲料中粗纤维含量为（30±0.02）％，实验组1和实验组2饲料中粗纤维含量分别为（40±0.35）%和（50±0.42）%。这3组家蝇幼虫及各发育时期样本，实验组BG酶mRNA表达量及酶活性均高于对照组，且实验组2最高，组间比较差异有统计学意义（P<0.05）。
　　结论：（1）家蝇能够分泌内源性纤维素酶，具有BG、EG和CBH3种纤维素酶活性。（2）家蝇3龄幼虫的唾液腺、前肠、中肠、马氏管、体壁和气管上皮细胞都能产生和分泌内源性纤维素酶，而中肠和唾液腺是产生和分泌BG酶的最主要部位。（3）家蝇BG酶的表达水平随家蝇的发育逐渐增高（P<0.05），饲料中粗纤维含量增加时，BG酶表达量相应增加（P<0.05）。

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前言

第一章 家蝇纤维素酶系的探测

1.1 材料和方法

1.2 结果

1.3 讨论

第二章 家蝇3龄幼虫的组织学研究

2.1 材料与方法

2.2 结果

2.3 讨论

第三章 家蝇β-葡萄糖苷酶在3龄幼虫中的组织定位

3.1 材料与方法

3.2 结果

3.3 讨论

第四章 家蝇β-葡萄糖苷酶的表达差异研究

4.1 材料和方法

4.2 结果

4.3 讨论

结论

参考文献

本研究的创新点

在读期间发表文章

附：综述: 昆虫纤维素酶的研究进展

致谢

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