银杏黄酮苷元对ox-LDL诱导人主动脉内皮细胞凋亡及对GRP78、CHOP表达的影响

摘要

目的：观察银杏黄酮苷元（Ginkgo flavone Aglycone，GA）对氧化低密度脂蛋白（Oxidized Low Density Lipoprotein，ox-LDL）所致人主动脉内皮细胞凋亡的影响，同时观察内质网应激相关指标GRP78、CHOP mRNA的表达。
　　方法：体外培养人主动脉内皮细胞，将细胞随机分为以下组别：（1）空白对照组：无血清高糖培养基（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM）；（2）150mg/L ox-LDL损伤组：150mg/L ox-LDL与细胞共同培养24h；（3）GA各浓度组：不同浓度GA（7.5、15、30、60mg/L）分别与细胞培养1h,而后加入150mg/L ox-LDL继续培养24h；（4）JNK抑制剂组（SP600125）：20μmol/L SP600125与细胞预先培养1h，然后加150mg/L ox-LDL继续培养24h；采用普通倒置相差显微镜及 Hoechst33258荧光染色观察各组细胞凋亡的形态学变化；Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞仪（flow cytometry，FCM）检测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR检测内质网应激相关指标GRP78、CHOP mRNA的表达。
　　结果：1. GA抑制ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞凋亡
　　(1)倒置显微镜下细胞形态学的变化：与空白对照组比较，ox-LDL损伤组的内皮细胞皱缩成圆形，与周围细胞分离，细胞脱落悬浮于培养液中；与ox-LDL损伤组比较，不同浓度GA预处理组及JNK抑制剂组细胞损伤减轻，皱缩细胞减少，细胞间隙变窄。
　　(2) Hoechst33258染色荧光显微镜观察发现，与空白对照组相比，ox-LDL损伤组细胞出现大量的核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的凋亡细胞；与ox-LDL损伤组比较，不同浓度GA预处理组及JNK抑制剂组人主动脉内皮细胞中细胞核呈浓染致密的固缩形态或颗粒状荧光的细胞数明显减少，大部分细胞染色质呈弥漫均匀的低强度荧光。
　　(3)流式细胞仪结果显示：与空白对照组细胞凋亡率4.65±0.11％相比，ox-LDL损伤组细胞凋亡率24.75±0.40%（P＜0.01），而不同浓度GA（7.5、15、30、60mg/L）预处理组较ox-LDL损伤组细胞凋亡率降低，分别为23.49±0.45%，22.35±0.30%，16.90±0.36%，13.66±0.41%（P＜0.01），JNK抑制剂组细胞凋亡率16.74±0.35%,较ox-LDL损伤组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01），与30mg/L GA组之间的内皮细胞凋亡率比较无统计学差异（P>0.05）。
　　2. GA抑制 ox-LDL诱导的人主动脉内皮细胞凋亡相关基因表达
　　实时荧光定量PCR结果显示，与空白对照组相比，ox-LDL损伤组人主动脉内皮细胞GRP78、CHOP mRNA表达增加（P<0.01）；较ox-LDL损伤组，不同浓度GA预处理组人主动脉内皮细胞GRP78、CHOP mRNA表达减少，且有一定浓度依赖性（P<0.01）。与不同浓度GA预处理组相比，JNK抑制剂组GRP78、CHOP mRNA表达也减少，其中CHOP mRNA表达与在30mg/L GA预处理组中比较无统计学差异（P>0.05）。
　　结论:
　　（1）GA对ox-LDL诱导HAECs凋亡具有保护作用，且具有浓度依赖性；
　　（2）GA和JNK抑制剂对ox-LDL诱导HAECs凋亡的抑制作用可能与其下调GRP78、CHOP mRNA表达有关，JNK信号通路为GA发挥保护作用的途径之一。

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文献综述: 内质网应激与动脉粥样硬化