人脐带源间充质干细胞在造血干细胞共移植治疗中应用的实验研究

摘要

目的:本研究旨在建立一种分离、培养扩增脐带源间充质干细胞(hUC-MSC)的方法，通过对其基本生物学特性以及在促进造血细胞归巢，提高造血干细胞植入与造血重建、调节移植免疫中作用的研究，在临床前水平验证hUC-MSC支持造血的功能，以期找到一条通过hUC-MSC与造血干细胞共移植治疗来提高造血干细胞移植成功率的有效途径，以满足临床上日益增多的移植需求。 方法: 1．首先建立hUC-MSC分离和培养扩增的方法并通过细胞形态学，细胞增殖和传代培养生长曲线的绘制，成纤维样细胞集落形成实验，流式细胞仪检测细胞周期与免疫表型分析对其基本生物学特性进行研究。 2．通过RT-PCR检测hUC-MSC支持造血、促进造血归巢与植入相关分子表达；通过造血干祖细胞集落培养了解hUC-MSC维系造血的能力；通过示踪技术检测移植后24h，hUC-MSCs在NOD/SCID小鼠的体内分布以及其引导造血细胞在小鼠体内归巢的情况。 3．通过流式细胞仪检测hUC-MSC对脐带血T细胞及各亚型早期激活标志-CD69表达的影响和MTT法检测hUC-MSC对脐带血T细胞增殖的影响以了解其对T细胞免疫功能的调节作用。 4．最后通过建立hUC-MSC与脐带血共移植NOD/SCID小鼠的动物模型，分析移植存活率和造血植入程度(人CD45+细胞嵌合率)，在临床前动物实验水平了解hUC-MSC对造血干细胞移植的影响。 结论: 1.成功建立了从人足月脐带中分离培养扩增hUC-MSC的方法，操作简单、易行，所得细胞完全能够满足临床治疗的需要； 2.hUC-MSC具有间充质干细胞的基本生物学特性和表型特征，而其高增殖潜能的特点尤为突出。 3.初步探讨了3种hUC-MSC保存的有效方法，为建立脐带间充质干细胞库提供可能的实施方案； 4.hUC-MSC具有维持造血前体细胞长期存活，延缓分化，达到支持长期造血的能力； 5．hUC-MSC具有促进造血干祖细胞有效归巢与植入，加速造血重建的作用； 6．hUC-MSC对T淋巴细胞激活和增殖具有抑制作用，这种作用为非特异性的，呈剂量依赖性，提示了hUC-MSC的调节移植免疫的潜能，这为hUC-MSC应用于异基因造血干细胞移植预防和治疗移植排斥和移植物抗宿主病，提供了实验依据； 7．共移植动物模型进一步证实了hUC-MSC促进造血植入，支持造血重建，提高移植存活率的能力。

目录

声明

摘要

前言

第一部分hUC-MSC的分离和培养扩增及基本生物学特性研究

1.hUC-MSC分离、培养和传代、扩增

2.hUC-MSC细胞生长曲线的绘制

3.成纤维样细胞集落形成实验（Unit-fibroblast like colony-rorming assay,CFU-F)

4.hUC-MSC细胞周期测定

5.hUC-MSC免疫表型分析

6.不同状态下hUC-MSC培养扩增的比较

实验结果

结论

讨论

参考文献

第二部分hUC-MSC支持造血、促进造血归巢与植入的研究

1.RT-PCR检测hUC-MSC支持造血、促进造血归巢与植入相关分子表达

2.造血干祖细胞集落培养(Hemato0poietic colony forming assay)

3.hUC-MSCs在NOD/SCID小鼠的体内示踪

4.hUC-MSC引导造血细胞在NOD/SCID体内归巢的示踪检测

实验结果

结论

讨论

参考文献

第三部分hUC-MSC对异源性脐带血T淋巴细胞激活与增殖的影响

1.流式细胞仪检测hUC-MSC对T细胞激活的影响

2.MTT法检测hUC-MSC对T细胞增殖活性的影响

实验结果

结论

讨论

参考文献

第四部分hUC-MSC促进异源性人脐带血的NOD/SCID小鼠移植

1.hUC-MSC的培养和胰酶消化

2.脐带血MNC的分离

3.hUC-MSC与脐带血MNC的NOD/SCID小鼠体内植入

4.NOD/SCID小鼠的饲养与观察

5.流式细胞仪检测NOD/SCID小鼠骨髓有核细胞中人CD45阳性细胞含量

6.统计学处理SPSS 11.5统计软件分析，X2检验

实验结果

结论

讨论

参考文献

总结

鸣谢

综述