造血干细胞联合间充质干细胞共移植治疗鼠系统性红斑狼疮的实验研究

摘要

[目的]
　　 研究异基因骨髓造血干细胞(hematopoietic stem cell，HSC)联合间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)共移植治疗MRL/lpr狼疮小鼠的临床疗效和移植前后淋巴细胞亚群的演变，监测嵌合体的形成，观察共移植对排斥反应的影响。
　　 [方法]
　　 (1)分离Balb/C小鼠骨髓来源MSC：分离雄性Balb/C小鼠(4周龄，20g)股骨、胫骨，冲出骨髓后采用贴壁培养法分离、扩增、传代、冻存、复苏MSC，并流式细胞术检测细胞表面抗原标志。(2)分离Balb/C小鼠骨髓来源HSC：冲出雄性Balb/C小鼠(4周龄，20g)骨髓后使用免疫磁珠分选Lin-CD117+HSC，并流式细胞术检测Lin-CD117+HSC的纯度。(3)实验动物分组：已发病的MRL/lpr小鼠随机分为5组。对照组：以生理盐水代替干细胞尾静脉输注；移植组：每只共接受1×106个干细胞，按HSC与MSC的比例不同共分为4组：HSC：MSC=1:5组、HSC：MSC=1:1组、HSC：MSC=5:1组和HSC：MSC=1:0组(单纯HSC移植组)。(4)移植后实验持续8周，每天观察小鼠的一般情况：进食、毛发、体重、精神等；移植前后进行尿蛋白定性、定量测定；检测外周血血肌酐、血常规；流式细胞术检测移植前后T淋巴细胞亚群(CD3+CD4+、CD3+CD8+)的变化；采用RT-PCR对移植后MRL/lpr小鼠嵌合体进行分析；光镜观察移植后受体的肾病理变化以及移植排斥反应。
　　 [结果]
　　 (1)MSC采用全骨髓贴壁培养法，5～7天后贴壁细胞可铺至培养皿皿底80％～90％。传至5、6代时细胞生长状态良好，为均匀的单一细胞，呈纺锤样，流式细胞术CD44+，Sca-1+，CD34-，CD117-。(2)成功自小鼠骨髓中分离纯化出Lin-CD117+细胞，通过流式细胞仪检测，Lin-CD117+HSC阳性率分选前为16.95％，分选后达91.82％。(3)在移植后8周内：①移植后2周内，各移植组小鼠的一般情况，如进食、精神状态、体重、毛发与对照组大致相同，但移植后第3周开始，各移植组小鼠逐渐出现体重减轻、精神状态欠佳、食欲下降，不同程度的脱毛等现象；②移植后各组均能获得较好的造血系统重建；③HSC：MSC=1:1组、HSC：MSC=5:1组、HSC：MSC=1:0组血肌酐较对照组下降(P<0.05)；④各组尿蛋白移植后较前上升，差异有统计学意义(P<0.05)，组间比较显示HSC：MSC=5:1移植组尿蛋白低于对照组及单纯HSC移植组，其差异具有统计学意义(P<0.05)；⑤T淋巴细胞亚群检测：移植后各移植组CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞较移植前高(P<0.05)；对照组CD3+CD4+和CD3+CD8+T淋巴细胞较前降低(P<0.05)；组间对照提示对照组与HSC：MSC=5:1组的CD3+CD4+T淋巴细胞差异有统计学意义(P<0.05)；组间对照提示CD3+CD8+T淋巴细胞差异无统计学意义。⑥嵌合体检测：移植后8周嵌合率HSC：MSC=5:1组呈升高趋势，但组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；⑦肾脏病理HE、PASM、Masson染色观察：移植前MRL/lpr小鼠呈狼疮肾炎性变，对照组系膜细胞肥大增生、基底膜增厚、间质炎症细胞浸润明显，各干细胞移植组移植后病理改变较前好转，以HSC：MSC=5:1组明显。
　　 [结论]
　　 HSC联合骨髓MSC共移植可以缓解鼠SLE近期以HSC：MSC=5:1移植组效果较为明显，远期疗效有待进一步研究。