肠球菌心内膜炎动物模型建立及粪肠球菌心内膜炎抗原的原核表达、纯化

摘要

目的：临床上肠球菌性心内膜炎发病日益增多，为了更好地研究肠球菌心内膜炎，本实验拟首先建立肠球菌心内膜炎兔动物模型，然后原核表达粪肠球菌心内膜炎抗原(efaA)蛋白，为临床肠球菌心内膜炎致病机制、诊断防治及寻求非抗生素疗法奠定基础。 方法： 1．动物模型建立：静脉导管插入术建立肠球菌心内膜炎动物模型。模型建立后解剖取兔肺动脉瓣赘生物，通过称量赘生物湿重、计数赘生物分离培养落数、菌落PCR检测、肺动脉瓣病理组织学HE染色，综合评价模型是否建立成功。 2．efaA蛋白的原核表达及纯化：Genebank中获得efaA基因全长。PCR扩增efaA基因片段，基因克隆技术构建pET30a-efaA重组载体。采用氯化钙共沉淀法将重组子转化至E.coli DH5 α和BL21(DE)。PCR、酶切、测序方法鉴定阳性重组子。IPTG诱导BL21(DE)细菌重组肠球菌efaA蛋白表达，SDS-PAGE、 Western Blot方法分析鉴定。His．Bind纯化试剂盒，分析重组蛋白的可溶性，亲和层析纯化重组蛋白，SDS-PAGE分析。 结果： 1．成功建立肠球菌心内膜炎兔模型，兔心内膜炎模型心脏可观察到有赘生物生成。肺动脉瓣赘生物重量是148 mg；赘生物匀浆后分离培养菌落计数为8.91log<,10>CFU/g；菌落PCR检测观察到与目的条带大小一致的特异性条带；肺动脉瓣病理组织学HF染色观察到有大量炎性细胞浸润，并见大量由血小板、纤维素、坏死组织、炎症细胞、大量细菌及肉芽组织所构成的赘生物附着在动脉瓣膜组织上。 2．成功构建PET30a-efaA重组子，在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白，获得小量纯化的重组蛋白。 结论： 1．成功建立肠球菌心内膜炎兔模型，该模型存在细菌性心内膜炎，有大量赘生物生成。 2．在pET30a系统中成功表达了efaA融合蛋白并小量纯化，为进一步大规模表达和纯化efaA蛋白，研究其生物学活性及临床诊断治疗奠定基础。

目录

论文说明：英文缩略语

声明

前言

第一部分：肠球菌心内膜炎实验动物模型的建立

材料和方法

结果

讨论

小结

第二部分：粪肠球菌efaA蛋白原核表达及纯化

材料和方法

结果

讨论

小结

参考文献

致谢

肠球菌感染性心内膜炎中粪肠球菌毒力因子的作用