应用四环素表达系统上调内源性TGF-β表达对HL-60细胞增殖、分化及凋亡的影响

摘要

TGF-β1是迄今为止了解的功能最复杂的细胞因子之一，目前已知的功能主要有调节细胞牛长和分化，诱导细胞凋亡，影响细胞粘连和细胞迁移，调节胚胎发育过程，促进细胞外基质的形成，促进创伤愈合，参与对免疫抑制及对炎症反应的调节等。近年来的研究表明。FGF-β及其受体与肿瘤的发生、发展密切相关，TGF-B对肿瘤的作用是多样的，在肿瘤发生的早期可作为抑癌基因抑制细胞的增殖和分化，但在肿瘤的进展期则可抑制免疫功能、增加血管的生成、诱导细胞外基质的产生而促进肿瘤的侵袭和转移。在造血调控方面，TVF-B，主要发挥负性调控作用，是目前己知作用最强的血细胞增殖抑制因子，但对白血病的作用机制还有许多未解之迷。 由于TGF-β1对不同的靶细胞表现出不同的牛物学活性，因此通过体外定时、定量的控制其在靶细胞中的表达，对进一步深入研究其作用及机制具有重要意义。 四环素诱导基因表达系统可以使基因表达在体外进行控制，在这一系统中，四环素(Tet)及其类似物强力霉素被作为有效的基因“控制开关”，这一系统的成功建立可以通过加入或移去四环素或类似物，对外源基因在有机体中表达进行准确、定量和特异地控制，为其应用于基因治疗提供新的手段。 本研究通过将含人全长TGF-β1(hTGF-β1)eDNA插入四环素调控系统，构建了带有hTGF-β1基因的四环素调控真核表达载体，用脂质体转染法将上述载体及peDNA6/TR双稳定转染HL-60细胞，用外源诱导物Tet准确定量调控TGF-β1在HL-60细胞的表达，研究这种细胞的生物学特性改变，同时观察转染外源性TGF-β1基因的HL-60细胞的体内致瘤性的改变，进一步探讨TGF-β1对白血病的作用及机制。 本研究内容分以下部分： 1.运用四环素调控系统，构建可调控的含人TGF-β1全长eDNA的真核表达载体。 2.将构建好的真核表达载体及pcDNA6/TR质粒双转染入HL-60细胞，筛选出稳定表达TGF-β1的转染细胞株。 3.通过Tet定量调控外源性TGF-β1在HL-60细胞的表达，研究不同TGF-β1表达水平对HL-60细胞增殖、分化、凋亡的影响。及其对bc1-2、c-myc、fas、bax、hTERT等凋亡相关基因与蛋白表达的影响。 4.通过Tet定量诱导外源性TGF-β1基因在HL-60细胞表达研究其在裸鼠体内增殖的影响。 取得了以下主要结果及结论： 1.本研究成功地构建含hTGF-β1的pcDNh4/T0真核表达载体，通过PCR鉴定、酶切鉴定并最终经测序确认，命名为pcDNA4-TGF-β1。 2.成功地筛选出双稳定转染pcDNA4-TGF-β1及pcDNA6/TR的HL-60单克隆细胞株，命名为TGFβ1-HL60细胞。 3.以TGFβ1-HL60细胞为研究对象，通过添加不同剂量诱导剂Tet上调转染细胞TGF-β1表达量，进一步证实了TGF-β1上调可抑制HL-60细胞增殖、促进HL-60细胞分化和诱导细胞凋亡；采用半定量RT-PCR及Western-Blot方法研究发现，TGF-β1能通过上调bax基因及蛋白表达，下调bc1-2、c-myc、fas、hTERT等凋亡相关基因及蛋白表达，从而诱导细胞凋亡。 4、体内实验发现通过腹腔注射诱导剂Tet可以影响TGFβ1-HL60细胞裸鼠异种移植瘤的生长，高剂量组(Tet 10mg/kg ip)和低剂量组(Tet 0.4mg/kg ip)对裸鼠异种移植瘤的抑制率分别为50.0％(p<0.01)和20.7％(p<0.05)。

目录

声明

前言

第一部分含人全长TGF-β1cDNA真核表达载体pcDNA4-TGF-β1的构建及其双稳定转染HL-60细胞的筛选

材料与方法

结果

讨论

第二部分TGF-β1基因修饰的HL-60细胞生物学特性研究

材料与方法

结果

讨论

第三部分TGF-β1定量表达对HL-60细胞裸鼠异种移植瘤作用的研究

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 Tet调控的基因表达系统的原理与应用

致谢