siRNA表达载体介导的RNA干扰抑制新型隐球菌cap10基因的表达

摘要

目的：构建针对新型隐球菌cap10基因的siRNA表达载体质粒，并转入新型隐球菌中，评价siRNA表达载体质粒对新型隐球菌(Cryptococcus neoformans，CN)荚膜相关蛋白(capsule associated protein，CAP)基因cap10表达的抑制效应，为新型隐球菌感染的治疗奠定基础。 方法：以cap10基因为靶基因，根据GenBank数据库提供的cap10基因核苷酸序列，按照干扰模板设计原则，应用网络在线软件确定一个针对cap10 mRNA的RNAi(RNAinteference，RNAi)靶点，设计1对可形成发夹结构的核苷酸序列，将其复性后插入载体质粒psilencer4.1-CMV neo，构建重组体。用LiAc化学法将重组质粒转染新型隐球菌细胞，确定G418筛选的浓度并筛选成功转染的阳性菌株。构建cap10基因表达荧光定量PCR检测体系：比对新型隐球菌5种血清型(A、B、C、D、AD)的cap10基因序列，找出同源序列来设计引物和探针，并将其PCR扩增基因片段克隆到pGEM-T Easy载体上，构建质粒标准品；建立FQ-PCR体系，优化反应条件，建立标准曲线，进行敏感性、特异性、重复性试验；将各组新型隐球菌培养后抽提总RNA，利用荧光定量检测体系分别测定各实验组cap10基因的表达情况。取培养后的新型隐球菌与巨噬细胞标准株J774A.1进行共孵育，经过PBS冲洗和甲醇固定，用吉姆萨染液对细胞进行染色，在显微镜下观察，计算吞噬率和吞噬指数。用SPSS13.0统计软件对结果进行统计学分析。 结果： 1.靶向cap10基因的siRNA表达载体质粒的测序结果与设计序列一致； 2.抽提新型隐球菌阳性克隆中的质粒，序列测序结果与设计序列完全相同。 3.cap10基因表达的荧光定量检测体系检测敏感度为104copies/μl，线性范围为104～1010 copies/μl，批内CV为0.31％，批间CV为2.73％。 4.pS4.1-siRC-1转染干扰组新型隐球菌的cap10基因表达平均拷贝数为175534.62copies/μl，明显低于对照实验组(321995.52copies/μl)和空白实验组(562931.66copies/μl)(均P<0.05)，平均抑制率为30.58％。 5.新型隐球菌与巨噬细胞株J774A.1共孵育后，pS4.1-siRC-1转染干扰组平均吞噬指数为0.128971212，吞噬率为10.06％，明显均高于对照实验组(0.078898104，6.57％)和空白实验组(0，0％)(均P<0.05)。 结论： 1.成功构建了针对cap10基因siRNA表达载体。 2.成功获得稳定转入的siRNA表达载体的新型隐球菌阳性株。 3.构建的荧光定量体系稳定、准确，敏感性为104拷贝数/μl，重复性好，特异性好，可以用于cap10基因表达的定量检测。 4.构建表达的siRNA成功抑制cap10基因表达，导致新型隐球菌逃避巨噬细胞吞噬的能力下降。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英汉缩略语名词对照

声明

前 言

第一部分用于RNA干扰新型隐球菌荚膜相关蛋白cap10基因siRNA表达载体的构建和鉴定

材料和方法

结果

讨论

第二部分siRNA表达载体介导的cap10缺陷模型的建立与鉴定

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 新型隐球菌与荚膜相关蛋白基因

致谢