乙肝病毒X基因对正常人肝细胞株HL-7702线粒体功能的影响及可能机制的探讨

摘要

目的：利用RNA干扰技术研究乙型肝炎病毒(HBV)X基因及其产物X蛋白(HBx)对正常人肝细胞株HL-7702线粒体功能的影响，并探讨其可能机制。 方法：利用分子克隆技术构建并鉴定靶向HBx的小干扰RNA(siRNA)重组表达质粒pX1和pX2，并以不针对任何序列的重组质粒pScr作为对照，通过脂质体介导转染入稳定表达HBx基因的正常人肝细胞株HL-7702/HBx，应用RT-PCR及Westem印迹分别从mRNA、蛋白水平检测其对HBx阻抑效应，并用流式细胞仪检测细胞内活性氧(ROS)和线粒体膜电位( AΨm)水平的变化。Westem印迹分别检测HL-7702/HBx组、转染pX1组、转染pScr组以及加入抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)组细胞氧化应激信号传导通路相关蛋白Bax、Bc1-2、细胞色素C(cyt C)、caspase-9和caspase-3的表达。 结果：酶切鉴定和测序结果证实了pX1和pX2的成功构建。pX1、pX2分别转染入HL-7702/HBx细胞48h后，与空白对照组比较，pX1和pX2两组HBx mRNA和蛋白表达水平均明显降低(P<0.05)，但pX1组抑制效果强于pX2组(P<0.05)。流式细胞仪分析显示经过RNAi后细胞内ROS水平明显降低，ΔΨm水平明显升高，与空白对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。Westem印迹检测显示，转染pX1的RNAi组和抗氧化剂NAC组与HL-7702/HBx组相比，线粒体Bax蛋白表达下调，Bc1-2蛋白表达上调，胞质中cyt C蛋白表达减少，线粒体中cyt C蛋白表达增加，同时细胞内活化的caspase-9和caspase-3蛋白表达均下调，差异均有统计学意义(P<0.05)。 结论：HBx能够降低宿主细胞线粒体膜电位，提高细胞内ROS水平，从而诱发线粒体氧化应激的产生，可能是通过激活线粒体损伤的内源性凋亡信号传导途径而发生作用。

目录

文摘

英文文摘

声明

前言

第一部分靶向HBx小干扰RNA重组表达质粒的构建和鉴定

材料和方法

结果

讨论

第二部分RNA干扰对HL-7702／HBx细胞HBVX基因表达的影响

材料和方法

结果

讨论

第三部分RNA干扰对HL-7702／HBx细胞线粒体功能的影响

材料和方法

结果

讨论

第四部分HBx基因引起细胞线粒体氧化应激可能机制的探讨

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

综述：RNA干扰在慢性乙型肝炎治疗中的进展