外周型苯二氮卓受体转运蛋白(TSPO)在小胶质细胞炎症反应中的作用及机制的探讨

摘要

目的：⑴研究TSPO表达与小胶质细胞炎症反应关系。⑵研究TSPO配体对小胶质细胞的激活抑制作用。⑶研究TSPO基因在小胶质细胞炎症反应中的作用。⑷研究TSPO配体抑制小胶质细胞活化的作用机制。
　　 方法：①在BV-2小胶质细胞培养体系上，加入LPS(100 ng/ml)分别于30 min，1 h，2h，4 h，6 h，12 h，24 h后用倒置相差显微镜观察BV-2细胞的生长分布状况及形态学改变，用ELISA测定BV-2细胞释放TNF-α、IL-1β和IL-6三种细胞因子水平。②在BV-2细胞培养体系上，加入LPS(100 ng/ml)分别于分别于4 h，8 h，24 h，48 h后用Real-time PCR检测TSPO在LPS诱导BV-2细胞中的表达。③BV-2细胞培养体系上，加入LPS(100 ng/ml)造成BV-2细胞活化状态的细胞模型，然后给予不同剂量(10μM、50μM、100μM)TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)，用ELISA和Real-time PCR观察不同剂量TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)对LPS诱导BV-2细胞分泌炎症因子的影响。④用TSPO siRNA转染BV-2细胞，转染48 h后，用在Real-time PCR和Western blot检测TSPO基因沉默效果；在转染TSPO siRNA BV-2细胞培养培养体系上，加入LPS(100 ng/ml)于4 h后用ELISA和Real-time PCR检测沉默TSPO基因对LPS诱导BV-2细胞分泌炎症因子(TNF-α、IL-1β和IL-6)的影响。⑤在转染TSPO siRNA BV-2细胞培养体系上，加入LPS(100 ng/ml)造成转染TSPO siRNA BV-2细胞活化状态的细胞模型，然后给予不同剂量(10μM、50μM、100μM)TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)，用ELISA和Real-timePCR观察不同剂量TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)对LPS诱导转染TSPOsiRNA BV-2细胞分泌炎症因子的影响。⑥通过Western blot技术检测给予不同剂量(10μM、50μM、100μM)TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)处理经LPS诱导的BV-2细胞内的Erk、JNK及p38的磷酸化程度及IκB的降解程度，从而了解TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)对BV-2细胞内MAPK及NF-κB的激活情况。⑦用流式细胞仪检测在100μM TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)作用24 h时单个VB-2细胞的荧光强度(MFI)，分析TSPO配体(PK11195和Ro5-4864)单个VB-2细胞内钙离子浓度([Ca2+]i)的影响情况。
　　 结果：⑴LPS可诱导BV-2细胞活化，表现为：BV-2细胞形态随着LPS作用时问延长逐渐变成呈现典型的阿米巴样“活化状态小胶质细胞”外观；活化的BV-2细胞合成、释放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子，并与LPS作用时间和剂量呈正相关。⑵TSPO在静息的BV-2细胞中有一定量表达，表达量不多，在LPS诱导BV-2细胞活化中表达增多，并随LPS干预时间延长而呈增多趋势，在LPS作用24 h时才有明显增多，48 h增多更显著(P＜0.01)。⑶TSPO配体PK11195和Ro5-4864有抗炎作用，它们能显著在抑制LPS诱导BV-2细胞分泌IL-1β和IL-6，并与剂量呈正相关，浓度越高，抑制效果越强。但对TNF-α没有抑制作用。对IL-1β，Ro5-4864抑制效果与PK11195相当，但对IL-6，Ro5-4864抑制效能比PK11195强，显示Ro5-4864比PK11195具有更强抗炎作用。⑷BV-2细胞转染TSPO siRNA后TSPO mRNA表达和蛋白含量均比对照组低，两者差异有统计学意义(P＜0.01)，表明TSPO siRNA能有效沉默TSPO基因表达。沉默TSPO基因后LPS活化BV-2细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6并没有减少，表明沉默TSPO基因对LPS活化BV-2细胞分泌的TNF-α、IL-1β和IL-6无抑制作用，提示TSPO基因不直接介导BV-2细胞的炎症反应，或者在BV-2细胞的炎症反应不是处于主导作用。⑸转染TSPO siRNA BV-2细胞在LPS+PK11195和LPS+Ro5-4864处理后IL-1β和IL-6的分泌量呈现明显下降；转染control siRNA BV-2细胞在同样LPS+PK11195和LPS+Ro5-4864处理后IL-1β和IL-6的分泌量也呈现明显下降，但它们之间差异无统计学意义(P＞0.05)。表明TSPO配体PK11195和Ro5-4864抑制LPS诱导BV-2细胞分泌IL-1β、IL-6不受TSPO基因的影响，提示TSPO基因不直接调节TSPO配体的抗炎作用，或者在TSPO配体的抗炎作用处于次要作用。⑹PK11195和Ro5-4864不影响LPS诱导BV-2细胞内Erk，JNK，p38蛋白磷酸化和IκB蛋白的降解，但能影响BV-2细胞内Ca2+浓度，PK11195能显著地引起BV-2细胞内Ca2+浓度增加，细胞内Ca2+荧光值(MFI)由1.95±0.16升高到3.37±0.14，两者之间差异有统计学意义(P＜0.01)；Ro54864却作用相反，能显著地降低BV-2细胞内Ca2+浓度，细胞内Ca2+荧光值(MFI)由1.95±0.16降低到1.56±0.09，两者之间差异有统计学意义(P＜0.01)。⑺TSPO配体PK11195和Ro54864能加快LPS诱导BV-2细胞IL-1β和IL-6mRNA降解速度，在PK11195作用1h、2 h后，LPS诱导BV-2细胞内IL-1β和IL-6 mRNA分别减少60.2％、64.3％和69.4％、74.1％；在Ro5-4864作用下，IL-1β和IL-6 mRNA分别减少58.2％、60.2％和66.9％、70.0％。IL-1β和IL-6 mRNA半衰期明显缩短，均由原来2 h缩短到1 h左右。表明PK1195和Ro5-4864能降低IL-1β和IL-6 mRNA稳定性。
　　 结论：①LPS可诱导小胶质细胞的应激活化，活化的小胶质细胞形态呈现阿米巴样“活化状态小胶质细胞”外观，并合成、释放TNF-α、IL-1β和IL-6等炎症因子。LPS是通过MAPKs信号转导通路和NF-κB转录因子转导来诱导小胶质细胞分泌炎症因子。②TSPO在小胶质细胞中确有表达，在静息的小胶质细胞中表达较低，在LPS诱导小胶质细胞活化中(在LPS作用24 h以后)呈现高表达，结合第一部分研究结果表明了TSPO表达与BV-2细胞的激活状态呈正相关。TSPO表达升高是小胶质细胞活化状态的后期反应事件，可反映小胶质细胞活化状态，可能参与调节小胶质细胞活化的功能。③TSPO配体PK11195和Ro5-4864有抗炎作用，它们能抑制LPS诱导的小胶质细胞活性，减少LPS活化小胶质细胞分泌IL-1β和IL-6等炎症因子。TSPO配体PK11195和Ro5-4864抑制LPS活化小胶质细胞分泌IL-1β、IL-6不通过TSPO基因(即不受TSPO基因的影响)，说明了TSPO基因不直接介入TSPO配体的抗炎作用，或者在TSPO配体的抗炎作用处于次要作用，起着传递信息作用，把信息传递给PBR另两个亚单位(VDAC和ANT)，进一步说明了PBR三个亚单位(TSPO，VDAC和ANT)是相互联系、相互作用形成一个复合体。异喹啉(PK11195)可单独结合到异喹啉结合点(TSPO)上，但与TSPO特异结合的苯二氮卓类药物(Ro5-4864)则需要这3个亚单位之间的相互作用。因此，Ro5-4864抑制LPS诱导BV-2细胞分泌IL-6的效能比PK11195强，而在抑制IL-1β上两者效果相当，显示Ro5-4864比PK11195具有更强抗炎作用。这些研究结果表明了反映了把原先称为PBR的DBI亚单位改称TSPO18 kDa[translocator protein18 kDa(转运蛋白18 kDa)]更能确切反应TSPO生理、药物功能，有利于进一步阐明PBR的结构和功能。④TSPO配体PK11195和Ro5-4864不是通过MAPKs信号转导通路和NF-κB转录因子转导来抑制LPS活化小胶质细胞分泌IL-1β、IL-6，而可能通过通过调节小胶质细胞内钙离子浓度，影响钙离子的信号转导通路来抑制炎症因子分泌。另外，PK11195和Ro5-4864影响IL-1β和IL-6 mRNA的稳定性，加快IL-1β和IL-6 mRNA降解，缩短IL-1β和IL-6 mRNA半衰期，从而减少IL-1β和IL-6蛋白的含量。⒂在影响小胶质细胞细胞内Ca2+浓度方面，PK11195和Ro5-4864的作用是相反的。PK11195能显著地增加小胶质细胞细胞内Ca2+浓度，Ro5-4864却能显著地降低小胶质细胞细胞内Ca2+浓度，结合上述TSPO在小胶质细胞炎症反应中作用，认为把PK11195和Ro5-4864统称为PBR拮抗剂和激动剂是不确切的，可能称为电压依赖性阴离子通道(VDAC)的拮抗剂和激动剂比较确切地反应它们的属性，这方面工作有待进一步研究。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：缩略语及中英文对照

声明

前 言

第一部分 LPS对小胶质细胞分泌炎症因子的影响

第二部分TSPO的表达及与其配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的作用

引言

第一节 TSPO在LPS诱导小胶质细胞活化中的表达

第二节TSPO配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的作用

第三节沉默TSPO基因对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的影响

第四节 在TSPO基因沉默下TSPO配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的影响

第三部分 TSPO配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的作用机制研究

引言

第一节 TSPO配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子的作用信号传导通路的研究

第二节TSPO配体对LPS诱导小胶质细胞分泌炎症因子mRNA稳定性的影响

结 论

参考文献

综述 外周型苯二氮卓受体转运蛋白(TSPO 18 kDa)与小胶质细胞

致 谢

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