应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究

摘要

目的：构建水痘-带状疱疹病毒(VZV)ORF62表达质粒，并应用VZV报告细胞系MV9G定量带细胞病毒(CAV)，以建立筛选抗VZV药物并研究其作用机制的新方法。
　　 方法：
　　 1、以VZV疫苗株BKvOka基因组DNA为模板、PCR扩增获得ORF62全序列后克隆到高效表达质粒pCAGGS中构建BKvOkaORF62表达质粒pCAG-BKvOka62，再应用双酶切和DNA测序法鉴定所构建质粒的正确性。
　　 2、将倍比稀释的BKvOka株感染MeWo细胞(含BKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后，分别用化学发光法检测BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、用间接免疫酶法染色并计数病毒蚀斑(focusnumbers)、用SYBRGreen荧光定量PCR法检测病毒DNA拷贝数(DNAcopies)，分别计算RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数的比值，分析其相关性，并建立RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。在培养基中加入阿昔洛韦(ACV)以抑制病毒生长，再以相同方法建立ACV作用下RLU-病毒蚀斑数、RLU-病毒DNA拷贝数和病毒DNA拷贝数-病毒蚀斑数的标准曲线。
　　 3、将随机稀释的GSKvOka株感染MeWo细胞(含GSKvOka株CAV)与MV9G细胞共培养72h后，仍用上述方法检测GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)、病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数。再以MV9G细胞荧光素酶RLU为基数，根据绘制标准曲线时所得RLU/病毒蚀斑数和RLU/病毒DNA拷贝数比值推算GSKvOka株蚀斑数和DNA拷贝数，获得病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值，并将预测值与其实测值比较，以验证应用MV9G细胞定量CAV的可行性。
　　 结果：
　　 1、通过将BKvOka株ORF62全序列克隆到pCAGGS表达质粒构建了VZVORF62重组表达质粒pCAG-BKvOka62。经双酶切反应和DNA测序鉴定，克隆的ORF62片段与预期一致，VZVORF62表达质粒pCAG-BKvOka62得以成功构建。
　　 2、将倍比稀释的BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后，BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r=0.999，P＜0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r=0.974，P＜0.01)，病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r=0.979，P＜0.01)，RLU/病毒蚀斑数=181.62，RLU/病毒DNA拷贝数=1.97×10-4。加入抗病毒药物ACV后RLU与病毒蚀斑数显著相关(r=0.991，P＜0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r=0.971，P＜0.01)，病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r=0.936，P＜0.05)。
　　 3、将随机稀释的GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养72h后，GSKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数显著相关(r=0.992，P＜0.01)、与病毒DNA拷贝数显著相关(r=0.988，P＜0.01)，病毒DNA拷贝数与病毒蚀斑数显著相关(r=0.966，P＜0.01)。根据GSKvOka株CAV激发MV9G细胞荧光素酶RLU值推算的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数预测值与其实测值基本一致。
　　 结论：
　　 1、成功构建BKvOka株ORF62表达质粒pCAG-BKvOka62，为荧光定量PCR法检测VZVDNA提供了质粒模板标准品，为进一步应用VZV报告细胞系定量CAV奠定了基础。
　　 2、以已知量BKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时，无论是否加入抗病毒药物ACV，BKvOka株CAV激发MV9G细胞表达的萤火虫荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数均显著相关。以未知量GSKvOka株CAV与MV9G细胞共培养时CAV激发MV9G细胞表达的荧光素酶(RLU)与病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数仍显著相关。根据RLU推算出的病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的预测值与其实测值基本一致。提示MV9G细胞与CAV共培养时受CAV激发表达荧光素酶RLU的变化可以反映病毒蚀斑数和病毒DNA拷贝数的变化。因此，应用MV9G细胞定量CAV是可行的。
　　 3、应用VZV报告细胞MV9G定量CAV克服了免疫酶染色法和荧光定量PCR法过程烦琐、难客观、易污染等缺点，具有简便、快速、敏感、客观和高通量的特点，为进一步建立抗VZV药物筛选和作用机制研究方法奠定了基础。

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引言

第一部分 水痘-带状疱疹病毒ORF62表达质粒的构建

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

第二部分 应用水痘-带状疱疹病毒报告细胞系定量带细胞病毒的研究

1.实验材料

2.实验方法

3.实验结果

4.讨论

5.结论

参考文献

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