豚鼠耳蜗离体外毛细胞Ca2+转运机制的研究

摘要

目的：观察发育过程中的豚鼠听性脑干诱发电位（Auditory Brainstem Responses ABR）阈值水平。探索豚鼠耳蜗外毛细胞(Outer Hair Cells，OHCs)的快捷分离方法并观察其活力，为OHCs的电生理实验提供快捷的实验方法。观察发育过程中豚鼠耳蜗外毛细胞Ca2+转运现象并探讨其转运机制，为临床听觉系统疾病的预防和治疗提供理论依据。
　　 方法：借助听力学检测仪器对不同年龄的豚鼠进行ABR阈值检测；采用机械与胶原蛋白酶消化相结合的方法快速分离耳蜗OHCs，并在倒置相差显微镜下观察其活力；借助非损伤微测技术，检测静息状态下的耳蜗单离OHCs的Ca2+流速，并观察尼莫地平对Ca2+流速的影响。
　　 结果：
　　 1、产后1天豚鼠较3天、7天和成年组豚鼠的ABR阈值高，高约8dB SPL(P<0.05ANOVA)。产后3天、7天组豚鼠的ABR阈值与成年豚鼠的阈值无明显差异(P>0.05ANOVA)，即3天组豚鼠ABR阈值已达到成年豚鼠听力水平。
　　 2、本实验所采用的分离方法可快速分离出足够数量、活性良好的耳蜗OHCs，其贴壁所需的时间较短，分离后静置7分钟即观察到贴壁。不同形态的OHCs在正常细胞外液中的存活时间不同，胞体较短的能存活3小时左右，胞体较长的能存活6-7小时。
　　 3、静息状态下豚鼠耳蜗单离OHCs和基底膜片段上的OHCs具有4种类型的Ca2+流动：OHCs头部Ca2+内流，尾部外排（Ⅰ型）。OHCs 头部Ca2+外排，尾部内流（Ⅱ型）。OHCs头部和尾部Ca2+均内流（Ⅲ型）。OHCs头部和尾部Ca2+均外排（Ⅳ型）。然而在整个耳蜗基底膜上仅发现Ⅰ型和Ⅲ型Ca2+流动趋势。且尼莫地平对耳蜗静息状态下OHCs的Ca2+流速具有明显的抑制作用，OHCs头端的Ca2+的抑制率可达76.78％，尾端的抑制率可达100％。
　　 4、发育过程中的豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca2+流速逐渐增大。产后1天豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca2+流速明显小于正常成年豚鼠的Ca2+流速(P<0.05 ANOVA)，大部分的产后3天、7天豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca2+流速已接近成年水平(P>0.05ANOVA)。
　　 结论：
　　 1、采用机械分离结合酶消化的方法分离耳蜗OHCs，可获得足够数量的形态和活性良好的、存活时间较长的OHCs，可满足大多数电生理实验的要求。
　　 2、成年豚鼠耳蜗OHCs在静息状态下存在Ca2+流动，并且趋势是多样的，但其主导趋势尚不明确，仍需进一步研究。
　　 3、发育过程中的豚鼠耳蜗单离OHCs的Ca2+流速逐渐增大。产后3天即可测到明显的Ca2+流速，并且大部分已达到正常成年豚鼠Ca2+流速的水平，为我们进一步研究其离子转运机制奠定了基础。

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讨论

结论

参考文献

致谢

综述：Ca2+在耳蜗外毛细胞中的生理作用及其调节因素

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