慢病毒载体介导的livin基因沉默对人肺腺癌裸鼠移植瘤生长及凋亡的影响

摘要

背景：
　　 肺癌是人类癌症死亡的主要原因之一。其中，非小细胞肺癌(non—small cell lung cancer，NSCLC)最为常见，占肺癌的75～80％。Livin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAP)家族成员，本课题组的前期实验证实慢病毒载体介导的LivinSiRNA在体外可以有效地促进SPC-A-1细胞的凋亡，抑制肿瘤细胞的增长。本课题在此基础上构建人肺腺癌裸鼠移植瘤模型并将慢病毒携带的livin shRNA注射入瘤体内，以观察沉默livin的表达对SPC-A-1裸鼠移植瘤生长、凋亡以及细胞周期的影响，进一步观察livin是否可成为肺癌基因治疗的靶点，及体内注射慢病毒shRNA的治疗效果。
　　 目的：
　　 利用慢病毒携带的livin shRNA注射肺腺癌裸鼠移植瘤，干扰livin基因表达，观察其对肺腺癌裸鼠移植瘤生长及细胞凋亡、周期、增殖的影响。
　　 方法：
　　 将SPC-A-1细胞接种至 BALB/C 裸鼠右腋皮下，建立SPC-A-1裸鼠皮下移植瘤模型，接种后第8天（移植瘤长至100mm3左右），按瘤体大小随机分成三组：空白对照组、阴性载体对照组、治疗组。分组后连续四天对三组裸鼠给予不同干预①治疗组：瘤内注射 livin shRNA慢病毒颗粒（2×106TU，5ul）；②阴性载体对照组：瘤内注射携带无关序列的慢病毒颗粒（2×106TU，5ul）；③空白对照组：瘤内注射生理盐水（5ul）。观察裸鼠的一般情况、移植瘤生长情况，测量瘤体体积、瘤体重量，并绘制肿瘤生长曲线、计算抑瘤率、western-blot方法检测各组livin表达。原位末端转移酶标记法（TdT-mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）、流式细胞仪Annexin V-FITC/PI双染检测移植瘤组织凋亡情况，PI单染法检测移植瘤细胞周期分布情况。3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐比色法（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide，MTT）检测细胞增殖能力。
　　 结果：
　　 1、livin shRNA慢病毒治疗组livin蛋白表达较对照组明显降低，(P<0.01，P<0.01)，提示慢病毒注射瘤体后显著干扰其表达。
　　 2、与空白对照组和阴性载体对照组相比，治疗组瘤体生长减缓，移植瘤体积、重量明显减小(F=254.64，P=0.00)。
　　 3、沉默livin基因后细胞凋亡明显增加：凋亡指数：（31.48±3.79）％vs（6.55±1.30）％；（7.47±1.28）％，F=203.28，P=0.00。凋亡率：（15.47±1.14）％vs（4.42±0.76）％；（5.26±1.02）％，F=116.39，P=0.00）。
　　 4、细胞周期检测结果显示，livin shRNA治疗组移植瘤细胞进入G0／G1期的细胞增多，进入S期的细胞减少，SPC-A-1细胞周期出现G0／G1期阻滞。
　　 5、MTT显示细胞增殖减缓， 72h细胞增殖抑制率最高，达到（31.15±4.62）％。
　　 结论：
　　 在SPC-A-1裸鼠移植瘤中瘤内注射慢病毒介导的livin shRNA成功沉默移植瘤中livin的表达，裸鼠移植瘤细胞周期阻滞，细胞凋亡增加、增殖明显受到抑制，Livin基因可望成为肺癌治疗的新靶点，慢病毒介导的RNA干扰技术可望成为有效的基因治疗工具。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：英文缩略词表

声明

前 言

第一部分 人肺腺癌裸鼠皮下移植瘤治疗模型的建立

第二部分 RNA干扰livin基因表达对荷瘤裸鼠移植瘤细胞周期、凋亡及增殖能力的影响

参考文献

致 谢

综述 凋亡抑制蛋白Livin与肺癌关系的研究进展