核因子-κB信号通路参与人骨髓间充质干细胞增殖/凋亡调节

摘要

目的:探讨核因子κ B(Nuclear Factor—κ B,NF—κ B)信号通路是否参与调节人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs)的增殖及凋亡作用。
　　 材料和方法:(1)贴壁法获取骨髓间充质干细胞:取股骨头置换或全髋关节置换患者股骨髓腔内骨髓血混合物,通过差速贴壁法分离培养纯化鉴定骨髓间充质干细胞,进行形态学观察。(2)流式细胞术鉴定表面分子表达:采用细胞表面分子标志流式抗体荧光染色后,用流式细胞方法检测细胞表面分子表达。(3)应用蛋白凝胶电泳(western blotting)的方法检测药物干预(激活剂脂多糖,Lipopolysaccharides,LPS；抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐,PDTC)后NF—κ B表达水平以及增殖、凋亡相关蛋白变化。(4)另用蛋白凝胶电泳分别检测相关蛋白如PARP、PCNA等蛋白表达的变化。(5)细胞增殖检测:用MTT比色方法检测骨髓间充质干细胞在LPS及PDTC的作用下其增殖的变化。(6)细胞凋亡检测:通过将细胞标记PI后进行流式细胞分析检测在NF—κ B信号通路激活后细胞凋亡变化。
　　 结果:(1)从手术中人股骨髓腔内收集的骨髓能够分离培养纯化出骨髓间充质干细胞,经形态学观察,其形态学表现与间充质干细胞外观一致。(2)流式细胞术检测显示该细胞表面表达分子与间充质干细胞表达分子一致,证实本实验培养细胞即为间充质干细胞。(3)向纯化的骨髓间充质干细胞内分别及同时加入脂多糖(LPS,1ug/ml)和吡咯烷二硫代氨基甲酸盐(PDTC,25mM)后,在LPS作用下,NF-κ B通路中蛋白p65表达水平升高,提示NF—κ B通路激活。(4)其他相关蛋白表达也受到影响,增殖相关蛋白PCNA及凋亡相关蛋白PARP发生相关变化(经统计P<0.05)。(5)细胞增殖实验显示,hMSCs在LPS刺激下,细胞短期内增殖受到刺激作用(经统计P<0.05)。(6)流式细胞分析显示,NF—κ B信号通路激活后,骨髓间充质干细胞凋亡水平较正常降低,抑制NF—κ B后,凋亡水平则较高(经统计P<0.05)。
　　 结论:(1)从手术患者髓腔内取血能够培养出人骨髓间充质干细胞,经表面分子鉴定后证实是间充质干细胞。(2)在脂多糖作用下,NF—κB信号通路中p65蛋白和磷酸化p65蛋白表达水平增高,表明NF-κB信号通路激活,继而促成其他蛋白如PARP、PCNA等表达增高,促进细胞增殖,同时有一定的抗凋亡作用。

目录

文摘

英文文摘

前言

第一部分 骨髓间充质干细胞的分离培养纯化鉴定

1.1 实验材料与主要试剂及仪器

1.2 主要实验方法

1.3 实验结果

1.4 讨论

1.5 小结

第二部分 NF-κB参与间充质干细胞增殖调节

2.1 实验材料与主要试剂及仪器

2.2 主要实验方法

2.3 实验结果

2.4 讨论

2.5 小结

结论

参考文献

致谢

综述

参考文献