慢病毒介导RNAi抑制WWTR1基因表达对结肠癌RKO细胞生物活性的影响

摘要

结肠癌是最为常见的恶性疾病之一。尽管近年来结肠癌诊治取得了较快的发展，但目前治疗效果仍难让人满意，手术后或化疗后的患者仍有近半数出现肿瘤复发或者转移。因此寻找新的治疗靶点及方法对于提高结肠癌的治疗效果极为重要。而寻找新型功能分子，并研究其作用机制和干预策略就具有重要的意义。
　　含有WW结构域的转录调节子1(WW-domain containing transcription regulator1,WWTR1)又叫做TAZ（Transcriptional co-activator with PDZ binding motif)，在哺乳动物的组织发生、发育中发挥重要的作用。WWTR1还被发现可以和转录因子PPAR-γ, Runx2和Smad结合参与调控干细胞的分化及再生。最近，在乳腺癌及肺癌中均发现高表达的WWTR1。过表达的WWTR1在乳腺癌细胞中可以促进肿瘤的转移及侵袭，而抑制WWTR1的表达则明显降低了乳腺肿瘤细胞的成瘤率，这一发现提示WWTR1是一个新的癌基因，并在乳腺癌的发生中具有重要的作用。然而WWTR1是否与结肠癌相关尚未见报道。
　　在本实验中，我们将探讨WWTR1在结肠癌的发生中的重要作用。利用RNAi技术抑制结肠癌细胞中WWTR1的表达，可以在体外显著抑制结肠癌细胞的增殖，并抑制其体内的成瘤率。本实验证明：WWTR1可以成为新的结肠癌治疗靶点。文章主要从以下几部分展开论述：
　　第一部分 WWTR1-siRNA设计、合成及转染目的细胞
　　目的：设计并合成人WWTR1基因的小分子干扰RNA，构建RNAi慢病毒载体，转染人结肠癌RKO细胞。方法：遵循RNA干扰目标序列的选取原则，利用互联网资源对人WWTR1基因mRNA序列设计并合成小干扰RNA（siRNA），退火处理后克隆至pGCSIL-GFP质粒，构建重组质粒pshWWTR1。酶切并测序鉴定。将重组质粒转染人结肠癌RKO细胞，采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western印迹分别从mRNA和蛋白水平检测WWTR1表达。结果：成功设计并合成人WWTR1基因的小分子干扰RNA。pshWWTR1经鉴定与设计序列完全一致，转染重组质粒72小时后，可以显著抑制RKO细胞WWTR1- siRNA表达，与对照组差异有显著性（P<0.001）。能在mRNA和蛋白水平上下调人结肠癌RKO细胞中WWTR1基因的表达（P<0.05）。结论：成功设计并合成了人WWTR1基因的小分子干扰RNA，成功转染人结肠癌RKO细胞，为进一步的细胞实验提供了条件。
　　第二部分 抑制WWTR1表达对人结肠癌RKO细胞增殖的影响
　　目的：体外观察抑制WWTR1活性对RKO细胞生物学活性的影响，通过裸鼠体内实验，进一步验证抑制WWTR1表达对结肠癌致瘤的影响。方法：应用pshWWTR1瞬时转染RKO细胞，Cellomics细胞计数检测细胞的生长曲线，FACS法检测细胞周期，Brdu检测细胞内DNA合成，Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡，检测实验组及对照组克隆形成能力，并通过裸鼠成瘤检测体内抑制WWTR1表达对结肠癌致瘤的影响。结果：pshWWTR1转染RKO后第4天开始细胞增殖受到抑制，DNA合成开始减少（P<0.01），第5天时细胞增殖被明显抑制（P<0.01）；RKO-KD组中G0/G1期细胞（54.61％）较NC组明显增多（P<0.05），而S期则KD组(31.7%)明显少于NC组的42.9%(P<0.05)；RKO细胞的凋亡率（4.34％）明显比对照组（2.05％）升高（P<0.01）；RKO－KD细胞克隆形成较NC细胞明显减少(P<0.05)；裸鼠上RKO KD组成瘤潜伏期延长、生长曲线、瘤体积和瘤重与对照组比较（P均<0.05）。结论：抑制WWTR1活性能抑制RKO细胞增殖、DNA合成及克隆形成能力，同时促进细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡。体内实验表明抑制肿瘤细胞WWTR1表达可以有效抑制肿瘤的生长。WWTR1可能是结肠癌治疗新的靶点。
　　第三部分 下游基因mRNA表达水平检测及相关机制分析
　　目的：探索WWTR1对结肠癌细胞增殖活性的分子机制。方法：通过查阅文献，挑选可能的下游基因，并通过RT－PCR检测目标基因 mRNA表达变化。结合DAVID及KEGG基因信息网站，对结果进行分析，以进一步探讨相关机制。结果：在RKO－KD细胞中ASNS基因表达明显降低，SMAD3、ID1、BTC表达均有明显上调，而BAX、BAK1这两个基因的表达也有一定程度的上调。结合DAVID及KEGG分析，除了Hippo通路外，TGF-β及结肠癌通路均与WWTR1对结肠癌细胞增殖作用的调控相关。结论：抑制WWTR1表达引起促增殖基因表达降低，而促凋亡基因表达上调，并通过Hippo通路与TGF-β、结肠癌通路交互作用，从而对结肠癌细胞的增殖产生抑制作用。

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缩略词表

前言

参考文献：

第一部分WWTR1-siRNA设计、合成及转染目的细胞

（一） 试剂与材料：

（二）实验方法：

（三） 结果

（四）讨论：

（五）结论：

参考文献：

第二部分抑制 WWTR1表达对RKO细胞生物学的影响

（一） 实验材料：

(二)实验方法:

(三)实验结果:

（四）讨论：

（五）结论：

参考文献：

第三部分 下游基因mRNA表达水平检测

（一） 实验材料：

（二）实验步骤：Real-time PCR检测(protocol)

（三）结果：

（四）讨论：

（五） 结论：

总结

参考文献

在读期间发表论文

致谢

结直肠癌分子靶向治疗的研究进展

参考文献：