酵母双杂交筛选与乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白相互作用的肝细胞蛋白

摘要

乙型肝炎病毒剪接特异性蛋白（hepatitis B spliced protein，HBSP）由2447nt-489nt单剪接型2.2KbHBV剪接变异体编码产生，与病毒的致病性及持续性感染相关，但其具体机制尚未阐明。本研究首先利用经典的细胞核酵母双杂交筛选与HBSP相互作用的肝细胞蛋白，共获得1166个阳性克隆，进一步在酵母体内进行验证，去除假阳性和重复克隆后共得到金属硫蛋白（metallothionein-2，MT2），乙醇脱氢酶（alcohol dehydrogenase1A(class I)，alpha polypeptide，ADH1A），tRNA剪接内切酶（tRNA-splicing endonuclease subunit34，TSEN34），乙酰辅酶A酰基转移酶（acetyl-CoA acyltransferase2，ACAA2)等38个与HBSP相互作用的猎物蛋白。选取乙醇脱氢酶1A（ADH1A）验证其与HBSP在哺乳动物细胞体内外的相互作用。为此，构建 pGEX-4T-1-HBSP载体，转化大肠杆菌并纯化获得GST-HBSP融合蛋白，以RT-PCR技术从HepG2细胞扩增得到ADH1A全长基因，构建pCMVTNT-ADH1A载体，体外转录翻译出ADH1A蛋白，GST pull-down实验证实ADH1A蛋白可以和HBSP体外相互作用。将HBSP重组腺病毒感染肝癌细胞株，进行内源性免疫共沉淀实验，证实HBSP和哺乳动物细胞内源性ADH1A具有相互作用。本研究为今后进一步探讨HBSP致病性奠定基础。