ERK1/2信号转导途径在胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用研究

摘要

恶性肿瘤是危害人类健康和生命的头号杀手，肿瘤的侵袭转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。在查阅大量文献和本室原有工作的基础上，本研究应用免疫组化、RNA干涉(siRNA)、基因转染、Western blot、RT-PCR等技术，探讨细胞外信号调节激酶1和2（ERK1/2）信号转导途径在胃腺癌细胞侵袭和转移中的作用，并探究ERK1/2在LPS等炎症因子介导的信号途径中发挥作用的上游信号分子MEKK3是否亦参与调控胃腺癌细胞侵袭和转移，旨在为阐明其作用及可能的作用机制并为发现可能的治疗药物作用的靶点奠定基础。
　　胃癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在全球范围内仍是主要癌症死亡原因之一。在我国，胃癌是第三大常见肿瘤，在福建等沿海地区，其死亡率位居各种癌症之首。尽管临床治疗方法、外科手术技巧在不断提高，化疗和放疗在不断发展，但对于已发生转移或无法手术的患者，5年生存率仍然很低。因此，本课题选择胃腺癌细胞进行研究。
　　本研究第一部分首先应用免疫组化方法测定磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2，ERK1/2的活性形式)在胃腺癌组织中的表达，结果表明：当脱石蜡后的切片与特异性的抗p-ERK1/2的抗体反应后，105例样本中，可见57例胃腺癌细胞浆和细胞核均有阳性表达，阳性率为54.28％，与正常配对的胃组织比较差异具有统计学意义（P<0.05）；p-ERK1/2在胃腺癌细胞中的表达与患者的年齡、性别、肿瘤大小无关，也与肠型或弥散型以及分化类型无关，但与肿瘤TNM分期、淋巴结转移及肿瘤侵及浆膜外密切相关。免疫组化结果表明：p-ERK1/2的表达与胃腺癌的转移密切相关。
　　以第一部分的结果为依据，本研究的第二、三部分着眼于探讨ERK1/2及其其在LPS等炎症因子介导的信号途径中发挥作用的上游信号分子MEKK3在胃腺癌细胞的迁移和侵袭中的作用。
　　本研究第二部分应用本室其他人员构建和鉴定成功的pcDNA3.1/Hygro(+)-MEKK3真核表达载体以脂质体(LipofectamineTM2000)将其转染入胃腺癌AGS细胞中、将已构建、包装和鉴定成功的腺病毒pAd-MEKK3-siRNA载体所形成的MEKK3 siRNA腺病毒颗粒转导AGS细胞，前者Western blot结果显示MEKK3蛋白在细胞中表达增强，表明应用潮霉素筛选获得了MEKK3高表达的稳定细胞克隆株；后者Western blot结果显示MEKK3蛋白在细胞中表达明显下调，进一步保证了后续的研究。
　　本研究第三部分分别应用Western blot和Transwell测定检测未转染的胃腺癌AGS细胞、用ERK1/2 siRNA敲减ERK1/2的表达或用ERK1/2信号途径抑制剂U0126抑制ERK1/2激活的AGS细胞和转染siRNA阴性对照的AGS细胞的ERK1/2的表达及在EGF刺激下的迁移和侵袭能力的改变。结果表明：ERK1/2 siRNA可有效抑制ERK1/2的表达；EGF的刺激，可增加AGS细胞的迁移和侵袭；当用ERK1/2 siRNA敲减ERK1/2的表达或用ERK1/2信号途径抑制剂U0126抑制ERK1/2的激活时，EGF介导的AGS细胞的迁移和侵袭显著降低，与相应的对照细胞比较，差异具有统计学意义，p<0.05。当所转染的ERK1/2 siRNA在50-200nM或所用的抑制剂U0126在0.5-2μM范围时，观察到了剂量依赖的关系，亦即：所转染ERK1/2 siRNA越多、ERK1/2表达降低越显著、AGS细胞的迁移和侵袭细胞数也越少；同样的，使用越大剂量的U0126预处理细胞、AGS细胞的迁移和侵袭细胞数降低的也越多。这些结果，表明了ERK1/2作用的特异性。为了探究MEKK3是否在ERK1/2调控的胃腺癌AGS的迁移和侵袭中发挥作用，本研究在MEKK3过表达的AGS稳定转染细胞中，检测了磷酸化ERK1/2的表达和细胞迁移和侵袭能力的改变。Western blot结果表明，MEKK3过表达的AGS稳定转染细胞株，其磷酸化ERK1/2的表达明显较空载体稳定转染细胞株强，表明了过表达MEKK3可增强ERK1/2的活性，MEKK3是ERK1/2信号途径的主要信号分子之一。Transwell测定结果表明，MEKK3过表达的稳定转染的AGS细胞，其细胞迁移和侵袭数增加，与空载体稳定转染的细胞株对比，差异具有统计学意义（p<0.05）。RT-PCR测定结果表明：AGS细胞转染ERK1/2 siRNA或在接受EGF刺激前，先用U0126预处理细胞时，其细胞MMP-9mRNA表达均低于转染siRNA阴性对照的或未接受U0126预处理的细胞（p<0.05），AGS细胞转染MEKK3真核表达载体后MMP-9mRNA表达明显高于转染MEKK3空载体的细胞（p<0.05）。
　　初步结果提示：p-ERK1/2的表达与胃腺癌细胞转移密切相关、与患者预后不良密切相关；ERK1/2对胃腺癌细胞的侵袭转移起重要的调控作用；过表达MEKK3可增强ERK1/2的活性、并增强胃腺癌细胞的迁移和侵袭、MEKK3的这一作用是通过激活ERK1/2而发挥的、因而MEKK3是ERK1/2信号途径的主要信号分子；ERK1/2调控胃腺癌细胞的转移机制之一可能是通过增加MMP-9的表达而实现的，其侵袭和转移的分子机制有待进一步深入研究。

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前言

第一部分免疫组化方法测定磷酸化ERK1/2在胃腺癌组织中的表达

引言

讨论

小结

第二部分MEKK3过表达和低表达细胞株的获得

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

第三部分ERK1/2及其可能的信号途径的主要信号分子MEKK3在胃腺癌AGS细胞的迁移和侵袭中的作用研究

引言

材料和方法

结果

讨论

小结

总 结 论

参考文献

致谢

综述

参考文献：