DcR3和EGFR基因共沉默抑制对人结肠癌细胞株SW480体外生长影响的研究

摘要

目的：DcR3诱骗受体3(decoy receptor3，DcR3)是Pitti RM等在1998年发现的一种新的肿瘤坏死因子受体（tumor necrosis factorreceptor），TNFR超家族成员，并命名为DcR3诱骗受体3(decoy receptor3，DcR3。DcR3缺乏跨膜序列，是一种分泌蛋白，具有调节细胞生长发育和分化以及抗凋亡的生物学特性，具有广阔应用前景。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)介导的信号转导与细胞的增殖、分化、生存、转移等的调节息息相关，是肿瘤治疗的重要靶点，其靶向药物西妥昔单抗已经应用于临床且取得良好的效果。RNA干扰是一种基因表达抑制的方法，由序列特异性的双链RNA（小片断RNA大约21-23bp即siRNA）所诱导的基因沉默现象，具有高度特异性和高效持久性。本实验根据DcR3、EGFR的cDNA序列构建分别针对DcR3和EGFR的siRNA，探讨通过siRNA共沉默DcR3和EGFR对SW480细胞体外生长情况的影响的研究，并与沉默单个基因的作用效果进行比较。
　　方法：本实验根据DcR3、EGFR的cDNA序列分别设计和合成3对针对DcR3和EGFR的siRNA，分别通过脂质体将各个siRNA转染入SW480细胞，通过实时定量Realtime-PCR检测各个siRNA对其靶基因mRNA下调作用，通过Western blo t检测其靶基因蛋白的表达，分别筛选出针对Dc R3和EGF R抑制效果最强的siRNA，以脂质体转染法将针对DcR3和EGFR作用效果最强的siRNA单独或联合转染SW480细胞；通过MTT法检测转染后细胞增殖活性，流式细胞仪检测细胞凋亡状态，比较各处理组细胞的增殖活性和凋亡状态。
　　结果：①realtime-PCR检测发现，3对针对DcR3的siRNA对SW480细胞的靶基因的mRNA抑制效率为32％，42%，30%，3对针对EGFR的siRNA对SW480细胞的靶基因的mRNA抑制效率39%，63%，48%；通过western blot检查证实，这些siRNA对SW480细胞靶基因蛋白的表达抑制效果与realtime-PCR所检查结果基本一致；②单基因沉默组和双基因共沉默组均较对照组具有明显抑制人结肠癌细胞株SW480的增殖和诱导凋亡的作用（P<0.05）；③双基因共沉默组较单基因沉默组具有明显抑制SW480细胞增殖的作用(P<0.05)。转染48小时后双基因共沉默组转染细胞的凋亡率为（20.1±1.7）%，高于单基因沉默组Dc R3基因沉默凋亡率（16.5±2.2）%和EGFR基因沉默凋亡率（15.9±1.3）%(P<0.05)。
　　结论：①DcR3siRNA转染SW480细胞后可有效抑制人结肠癌细胞株SW480的DcR3mRNA和蛋白的表达，EGFR siRNA转染SW480后可有效抑制人结肠癌细胞株SW480EGFR mRNA和蛋白的表达。②转染DcR3siRNA和/或转染EGFR s iRNA的人结肠癌细胞株SW480均表现出明显的增殖抑制和凋亡促进作用。③共沉默DcR3和EGF R在抑制人结肠癌细胞株SW480增殖和诱导凋亡方面，与单基因沉默相比具有明显优势。

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前言

材料与方法

一、实验材料

（一）细胞株

（二）主要试剂

（三）主要仪器

二、实验方法

三、统计学方法:

结果

讨论

结论

参考文献

致谢

RNA干扰技术在结肠癌基因靶向治疗应用的研究

参考文献