登革病毒2型外膜E蛋白基因DIII区的表达及其在血清学诊断方面的应用研究

摘要

最近几十年来,由于全球人口数量和流动性持续增加,登革热在全球的流行范围不断扩大,并已成为目前世界上分布最广、发病最多的虫媒病毒病,对人类健康造成严重的威胁。由于缺乏疫苗,登革热的防治一直是世界性难题。除了媒介控制外,感染者的及时发现、隔离以及治疗是目前预防登革热进一步扩散的重要手段,因此,早期诊断对于登革热的预防控制至关重要。
　　登革热的早期诊断一直是登革热防治研究领域的热点,相关的实验诊断技术也在不断发展,包括病毒核酸检测、抗原抗体检测在内的多种实验诊断技术已被应用于常规的实验检测工作。目前,国外已经有多家试剂公司研制成功并推出了包括酶联免疫吸附法(ELISA)、胶体金免疫层析法(ICT)等在内的商品化病毒抗体检测试剂盒,此类试剂盒具有快速、操作简便等特点,为大多数实验室,特别是基层实验室所采用。近年来,国内虽然也有不少研究机构开展登革病毒抗体检测试剂盒的研制,并有相关研制的报道,但其实际应用一直没有取得突破,试剂的国产化一直是国内登革热防控工作的短板。
　　本课题以登革2型病毒外膜蛋白(envelope,E)为研究对象,在其编码基因的DIII区上下游各设计8条引物,分别引入NdeI和XhoI两个酶切位点,交叉配对共扩增出64条DIII区基因片段,利用pET30a(+)表达系统在大肠杆菌BL21(DE3)中分别克隆和表达,经SDS-PAGE和Westernblot验证其表达含量及重组蛋白的免疫反应性,筛选表达量大且有较强免疫反应性的重组蛋白抗原进行纯化并建立间接ELISA法用以检测登革热IgM抗体,为国产试剂提供候选抗原和方法。
　　为评价实验建立的ELISA法检测效果,我们以Panbio公司生产的登革热IgM检测试剂盒作为对照,选取112份临床血清标本进行了初步的试剂评估。检测结果表明,以IFA检测结果为金标准,本研究ELISA法检测IgM的灵敏度为94.64％,特异度为91.07%;与Panbio公司生产试剂盒相比,本研究建立的ELISA法检测登革病毒IgM抗体的检测阳性符合率为92.85%,阴性符合率为89.29%,总符合率为91.07%,Kappa值为0.8214,提示两检测方法具有较高的一致性,且两种检测方法差异无统计学意义(χ2=0.3,P>0.05)。提示本研究所建立的方法具有较好的应用前景。

目录

封面

声明

目录

中文摘要

英文摘要

主要英文缩写词

第一部分 引言

第二部分 材料与方法

一、材料

1．病毒株及细胞株

2．血清标本

3．质粒和菌种

4．细胞培养所用试剂

5．分子克隆所用的试剂

6．蛋白表达与纯化所用试剂

7．抗体

8．主要仪器和设备

9.主要的生物软件及分析工具

二、方法

1．病毒的增殖及间接免疫荧光法（IFA）验证病毒增殖情况。

2．病毒RNA的提取

3．Den2 E基因片段的扩增及TA克隆的构建。

4．Den2 E基因DⅢ区片段的扩增及表达载体的构建。

5．BL21（DE3）感受态细胞制备

6．重组蛋白的小量诱导表达及免疫反应性检测

7． 重组蛋白的大量表达与纯化

8．重组蛋白抗原应用于ELISA检测

9. IFA检测临床标本中抗体情况

10．ELISA结果的统计处理

第三部分 结果

一、病毒感染后的细胞形态变化及IFA检测结果。

二、Den2 全长E基因片段的扩增、TA克隆及序列分析

三、E基因DⅢ区的扩增及重组质粒的构建。

四、重组质粒的小量诱导表达与免疫反应性鉴定

五、重组蛋白的大量表达与纯化

六、重组蛋白F4R1间接ELISA法（下简称本研究ELISA法）检测临床血清IgM抗体

第四部分 讨论

第五部分 结论

参考文献

致谢

综述