针对TGF-β1启动子的ASODNs对新西兰兔腹主动脉支架植入后再狭窄及再内皮化的影响

摘要

虽然药物洗脱支架(DES)的应用在较大程度上解决了支架术后再狭窄(ISR)的问题,但是许多经皮冠脉介入治疗(PCI)的病人仍然出现ISR。此外,尽管DES可较为有效降低地ISR,但也引入新的问题,DES所携带的药物或/和涂层载体对局部血管再内皮化的不良影响可增加支架内血栓形成的风险。ISR高度局部化的特征使局部的基因治疗成为可能。基因治疗即将核苷酸,或者是功能基因或者是反义寡核苷酸(ASODNs)转移至个体的体细胞内发挥治疗作用。与其它基因技术相比,ASODNs具有诸多优点且应用成熟,将ASODNs与在疾病过程中起关键作用的特异性靶基因结合,具有靶向治疗高效及毒副作用少的优点。将ASODNs涂在药物支架系统,开发出新一代药物涂层支架,也是减少再狭窄的发生率及预防并发症发生的希望所在。
　　ISR是一个涉及到血管壁与植入物(包括支架本身,涂层药物及载体药物)相互作用的复杂过程,其主要的发病机制包括血管平滑肌细(VSMCs)的增殖与迁移、内皮细胞的损伤、局部血小板的集聚及炎症细胞的激活,而这其中最重要的机制是VSMCs的增殖与迁移。如何抑制VSMCs的增殖与迁移是防止PCI术后ISR的关键。生长转移因子-β1(TGF-β1)是蛋白质超家族中的成员,对VSMCs生长的调控、分化、迁移和凋亡起重要作用。在血管损伤后,TGF-β1被证实能刺激VSMCs的增殖和迁移,最终导致管腔狭窄。因此,我们设想合成针对TGF-β1基因启动子的ASODNs,通过特异性抑制TGF-β1的功能或持续表达,减少VSMCs的增殖和迁移,从而为防止ISR提供新的思路。
　　研究由两个部分组成:
　　①合成能特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs化合物。体外培养VSMCs,观察针对TGF-β1基因启动子的ASODNs对VSMCs的增殖和迁移的影响;
　　②制作特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs药物涂层支架,并将其植入新西兰兔的腹主动脉内,观察其对靶血管局部支架内再狭窄及再内皮化产生的影响。
　　一、针对TGF-β1启动子的ASODNs化合物对VSMCs增殖和迁移的影响
　　目的：合成能特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs化合物,通过体外培养VSMCs,观察其对VSMCs的增殖和迁移的影响
　　方法：构建新西兰兔TGF-β1基因启动子的报告基因质粒并将其转染入HEK293细胞,确定TGF-β1基因AP-1增强子位点,根据核苷酸碱基配对的原则确定能特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs结构式并合成ASODNs化合物。体外培养新西兰兔腹主动脉VSMCs并行α-肌动蛋白(α-SMA)特异性免疫细胞化学染色鉴定。通过血小板衍生因子(PDGF)10ng/ml诱导VSMCs生长后,将细胞实验共分为3组:分别为control(单纯加入PDGF)组,PDGF+ASODNs(10ug/ml)组,PDGF+mismatch ASODNs(10ug/ml)组。通过Westblot法测定各组细胞TGF-β1表达的情况,通过5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU)渗入法和水溶性四唑盐-1(WST-1)法测定各组细胞的增殖及代谢情况,通过Transwell细胞迁移实验观察各组细胞的迁移情况。
　　结果：采用胶原酶消化法培养原代VSMCs,细胞生长呈典型的“峰-谷”状,经α-SMA特异性免疫细胞化学染色后,细胞胞浆呈阳性反应,证实为VMSCs。加入PDGF(10ng/ml),能诱导VSMCs的代谢率增高,促进VSMCs的迁移与增殖。ASODNs能够显著抑制VSMCs的代谢率、VSMCs的迁移及VSMCs的增殖(P<0.01),而mismatch ASODNs则不能达到此效果(P>0.05)。
　　结论：针对TGF-β1基因AP-1启动子位点的ASODNs可特异性沉默TGF-β1基因,并能显著降低VSMCs的增殖和迁移。能特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs化合物应用于药物支架系统预防支架植入后再狭窄的作用值得进一步探讨。
　　二、针对TGF-β1启动子的ASODNs对新西兰兔腹主动脉支架植入后再狭窄及再内皮化的影响
　　目的：制作特异性沉默TGF-β1基因启动子的ASODNs药物涂层支架,并将其植入新西兰兔的腹主动脉内,观察其对损伤血管局部支架内再狭窄及再内皮化的影响,并探讨其机制。
　　方法：按照1.0μg/mm2的载药量构建2.0×12mm的ASODNs药物涂层支架。使用高效液相色谱法(HPLC)测定支架的体内外药物释放动力学。建立动物模型,在新西兰兔的腹主动脉内植入ASODNs药物涂层支架。实验共分为3组:裸支架组(n=10),ASODNs药物涂层支架组(n=10),mismatch ASODNs药物涂层支架组(n=10)。每组各3只动物于支架植入4周后处死,留取少量标本行HPLC检测后,将含支架的血管行扫描电镜检查观察各组的支架表面内皮化情况。另外每组各6只动物与支架植入8周后处死,留取少量标本行HPLC检测后,将标本分为两部分。一部分-80°C保存,使用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)及蛋白质印迹法(Western Blotting)法检测各组的TGF-β1、结缔组织生长因子(CTGF)的mRNA及蛋白表达情况,另一部分组织包埋入甲基丙烯酸甲酯中,分别从支架的近、中、远三处切取5μm的切片,然后行苏木精-伊红(HE)染色及弹力纤维(ETVG)染色,然后置于显微镜下观察并计算新生内膜厚度、新生内膜面积及血管狭窄面积的平均值。
　　结果：在体外试验中,ASODN药物涂层支架24h内ASODNs释放超过90％;但在体内试验中,支架植入4周和8周后,局部血管组织中分别仍有一定量和微量ASODNs留存。扫描电镜显示,裸支架、ASODNs药物涂层支架、mismatch ASODNs药物涂层支架表面均具有较高的内皮化程度。与对照组相比,裸支架组损伤血管局部的TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表达均明显升高(P<0.01)。ASODN药物涂层支架能够降低损伤血管局部的TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表达(P<0.01)。与裸支架组相比,ASODNs组支架内新生内膜面积明显降低(P<0.05),再狭窄程度明显降低(P<0.05);而mismatch ASODNs药物涂层支架的上述指标与裸支架相比均无明显差异(P>0.05)。
　　结论：针对TGF-β1基因启动子的ASODNs药物涂层支架尽管体外释放药物动力学不理想,但植入体内仍能够显著抑制血管局部的TGF-β1和CTGF的mRNA及蛋白表达,从而能显著减少支架内再狭窄,而且不影响支架表面的再内皮化。

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缩略词表

中文摘要

英文摘要

第一部分针对TGF-β1启动子的ASODN对VSMCs增殖和迁移的影响

前言

材料与方法

结果

讨 论

结 论

第二部分针对TGF-β1启动子的ASODNs对新西兰兔腹主动脉支架植入后再狭窄及再内皮化的影响

前言

材料与方法

结果

讨论

结论

全文总结

参考文献

博士期间发表的第一作者论文

致谢

综 述