替米沙坦对hcy诱导的人内皮细胞NADPH氧化酶表达的影响及与PPAR-δ的关系

摘要

目的:
　　观察替米沙坦对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NADPH氧化酶亚基gp91,p22表达的影响及ROS的形成,探讨其在抗氧化应激中与PPAR-δ的关系,阐明该药物抗动脉粥样硬化的可能机制。
　　方法:
　　应用Ⅰ型胶原酶消化法分离培养HUVECs;Real-timePCR法检测NADPH氧化酶gp91,p22mRNA表达;Western-blot法测NADPH氧化酶gp91,p22蛋白表达;二氯荧光乙酰乙酸盐染色测定细胞内活性氧(ROS)水平。实验分组:(1)空白对照组(2)同型半胱氨酸组(3)PPAR-δ激动剂组(4)PPAR-δ抑制剂组(5)PPAR-δ激动剂+抑制剂组(6)替米沙坦组(7)替米沙坦+PPAR-δ抑制剂组
　　结果:
　　(1)经体外胶原酶消化法分离培养的HUVECs,形态学观察呈典型的“铺路石”特征及免疫荧光鉴定大于95％的细胞呈vWF阳性,即为内皮细胞;(2)与对照组相比,Hcy呈浓度依赖性增加HUVECsROS水平,当Hcy10μM时,HUVECsROS含量显著增加(P<0.01);(3)与对照组相比,Hcy呈浓度依赖性促进HUVECsNADPH氧化酶亚基gp91,p22表达,当Hcy10μM时,gp91,p22mRNA表达显著增加(P<0.05);(4)替米沙坦呈浓度依赖性抑制Hcy(1000μM)诱导HUVECsROS水平,与Hcy组相比,替米沙坦为0.1μM时,HUVECsROS水平显著降低(P<0.05);(5)与对照组相比,替米沙坦能显著抑制HUVECsNADPH氧化酶亚基gp91,p22mRNA表达(P<0.05);(6)PPAR-δ激动剂(GW0742)可以抑制Hcy诱导的HUVECs内ROS形成,显著地降低NADPH氧化酶亚基gp91,p22mRNA表达及蛋白水平,PPAR-δ阻断剂(GSK0660)能显著抑制替米沙坦的上述效应。
　　结论:
　　(1)Hcy能诱导HUVECs内的ROS的水平及NADPH氧化酶gp91,p22mRNA表达;(2)替米沙坦可抑制Hcy诱导的人内皮细胞内ROS的水平及NADPH氧化酶gp91,p22的mRNA表达水平;(3)PPAR-δ阻断剂(GSK0660)可以阻断替米沙坦对Hcy诱导的HUVECs内的ROS形成及NADPH氧化酶gp91,p22mRNA表达的抑制效应。(4)替米沙坦降低HUVECs内的ROS水平,其保护效应可能是通过激活PPAR-δ,降低NADPH氧化酶亚基gp91,p22的表达水平。

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前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 细胞

1.2 主要试剂

1.3 主要器械仪器及耗材

1.4 主要试剂及其他溶液配制

2 实验方法

2.1 HUVECs的分离及培养

2.2 细胞鉴定

2.3 实验分组

2.4 细胞内ROS的荧光测定

2.5 总RNA的提取及Real-time PCR法

2.6 蛋白的提取和 Western blotting法

3 统计学方法

结果

1.1 细胞形态学的鉴定

1.2 免疫组织细胞荧光鉴定

2.1 Hcy对HUVECs内ROS生成的影响

2.2 Hcy对人内皮细胞gp91和p22表达的影响

3.1 替米沙坦对Hcy诱导HUVECs ROS生成的影响

3.2 Realtime PCR法检测替米沙坦对Hcy诱导的HUVECs gp91和p22 mRNA表达的影响

3.3 Western blotting法检测替米沙坦对Hcy诱导的HUVECs gp91和p22 蛋白表达的影响

4.1 替米沙坦对Hcy诱导的HUVECs ROS生成的影响

4.2 比较PPARδ特异激动剂与替米沙坦对Hcy诱导的HUVECs gp91和p22mRNA表达的影响

4.3 比较 PPARδ特异激动剂与替米沙坦对 Hcy 诱导的 HUVECs gp9和p22蛋白表达的影响

讨论

结论

参考文献

替米沙坦对同型半胱氨酸诱导的人内皮细胞 NADPH 氧化酶亚基gp91,p22表达的影响及与PPAR-δ的关系

致谢