乳铁蛋白通过IGF-Ⅰ/IGFBPs系统促进原代成骨细胞增殖与分化

摘要

目的:
　　观察不同浓度的乳铁蛋白(Lactoferrin LF)对原代大鼠成骨细胞增殖、分化及IGF-Ⅰ、IGFBP2基因表达的影响,探讨乳铁蛋白是否呈时间剂量依赖性促进成骨细胞增殖、分化及乳铁蛋白抗骨质疏松的分子机制,为临床用药提供实验依据。
　　方法:
　　(1)采用胰酶和Ⅰ型胶原酶混合酶消化法从新生乳鼠头盖骨中分离原代大鼠成骨细胞,并用碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色鉴定。
　　(2)不同浓度乳铁蛋白干预成骨细胞,实验分组为:对照组,LF1(0.1ug/ml),LF2(1ug/ml),LF3(10ug/ml),LF4(100ug/ml),LF5(1000ug/ml),在1,3,5,7天后分别采用噻唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,通过PNPP法测定其碱性磷酸酶活性反应细胞分化,RT-PCR法检测IGF-ⅠmRNA,IGFBP2mRNA的表达水平。
　　(3)利用RNA干扰技术,沉默大鼠成骨细胞中IGF-Ⅰ的表达。
　　(4)MTT法和PNPP法检测乳铁蛋白干预IGF-Ⅰ基因沉默后的大鼠成骨细胞的增殖、分化。
　　(5)统计学方法:各实验数据采用x±s表示,应用SPSS16.0统计软件进行统计分析,各组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。P﹤0.05,差异有统计学意义。
　　结果:
　　(1)原代培养的细胞具有成骨细胞的典型特征,碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶原免疫组化染色呈阳性。
　　(2)MTT法结果显示:干预第一天,各干预组除LF1组外均明显高于对照组(p<0.01),各孔吸光度值随着干预浓度的增大而升高。干预第三天,LF2、LF5组吸光度值较对照组差异有统计学意义(p<0.05),而LF3、LF4组较对照组有显著统计学意义(p<0.01),干预第五天,LF2、LF3组较对照组有统计学意义(p<0.05),LF4组明显高于对照组(p<0.01),LF5组则明显低于对照组(p<0.01),干预第七天,LF2组明显高于对照组(p<0.01),LF5组明显低于对照组(p<0.01),而LF3,LF4组虽高于对照组,但无统计学意义。同时,各干预组干预1,3,5,7天,各孔的吸光度值随着干预时间的延长而上升。
　　(3)PNPP法结果显示,LF1组对成骨细胞碱性磷酸酶活性无明显影响。LF2-5均可促进成骨细胞ALP活性。干预第七天LF5组的ALP活性值达到最大。同时,各LF组ALP活性值均随着时间的延长不断升高,且第七天显著高于第1,3,5天。
　　(4)实时荧光定量PCR结果显示:与对照组比较,干预1天后LF3-5组IGF-ⅠmRNA表达水平显著升高,LF1-5组IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.01);3天后,LF2组IGF-ⅠmRNA表达水平升高而IGFBP2 mRNA水平降低(均P<0.05),LF3,4,5干预组较对照组IGF-ⅠmRNA表达水平明显升高而IGFBP2 mRNA显著降低(均P<0.01);5天后,与对照组比较,各干预组IGF-ⅠmRNA组表达量均显著升高而IGFBP2 mRNA表达量均显著下降(P<0.01);7天后,与对照组比较,LF3,4,5组IGF-ⅠmRNA表达量明显升高,而LF4,5组IGFBP2 mRNA表达量明显下降,差异均有显著统计学意义(P<0.01)。
　　(5)经RNAi干扰使IGF-Ⅰ基因沉默后,RT-PCR结果及western blot结果显示IGF-Ⅰ基因被沉默。
　　(6)乳铁蛋白干预IGF-Ⅰ基因沉默后的成骨细胞,检测其增殖、分化,结果显示:与正常对照组比较,LF干预组促进成骨细胞增殖、分化(P<0.01),shRNA转染组,LF+shRNA转染组抑制成骨细胞增殖、分化(P<0.01),NC组与正常对照组之间差异无明显统计学意义(P>0.05)。shRNA转染组及LF+shRNA转染组与NC组比较差异有显著统计学意义(均为P<0.01)。LF+shRNA转染组与shRNA转染组比较差异无明显统计学意义(P>0.05),与LF干预组比较则差异有显著统计学意义(P<0.01)。
　　结论:
　　(1)混合酶消化法体外可分离成骨细胞,在采用多次“差速贴壁法”可以获得数量多且纯,并且活性很好的成骨细胞。
　　(2)乳铁蛋白呈时间、剂量性促进成骨细胞的增殖与分化。
　　(3)乳铁蛋白可以促进成骨细胞的IGF-Ⅰ基因mRNA的表达,抑制IGFBP2基因mRNA的表达。
　　(4)乳铁蛋白对成骨细胞的促增殖分化作用可能是通过上调IGF-Ⅰ基因,来实现的。

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前言

第一章 乳铁蛋白对原代培养的大鼠成骨细胞增殖分化的影响

一 材料

2、药物干预实验

三 结果

四 讨论

第二章乳铁蛋白促进大鼠成骨细胞增殖分化及其机制研究-----乳铁蛋白对RNA干扰IGF-Ⅰ表达后成骨细胞增殖分化的影响

第一部分 乳铁蛋白对成骨细胞IGF-Ⅰ,IGFBP2mRNA的影响

第二部分 IGF-1shRNA慢病毒载体构建

第三部分 慢病毒转染成骨细胞及有效靶点的筛选

第三部分 乳铁蛋白对IGF-Ⅰ基因沉默后的成骨细胞增殖分化的影响

全文总结

参考文献

致谢

综述