脆性位点基因WWOX在人肝细胞癌中的表达及其功能机制的实验研究

摘要

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是中国最常见的恶性肿瘤之一，HCC根治性切除后仍有很高的转移复发率，5年生存率很低。因此，研究 HCC发生发展的分子机制，寻找新的治疗方案具有重要的意义。目前认为HCC的发生与乙型、丙型肝炎病毒感染、饮酒、非酒精性脂肪肝及黄曲霉毒素的污染等因素相关，上述某些因素可以导致染色体脆性位点发生断裂，从而影响该位点区域功能基因的编码，使其改变或失活，在肿瘤的发生或进展中起重要作用。 WWOX基因是2000年由 Bednarek等分离鉴定出的一个新基因，位于人类染色体16q23区域，包含普通染色体脆性位点FRAD16。目前研究发现WWOX在多种肿瘤中出现异常表达，主要表现为 WWOX基因的异常转录剪接体的出现及蛋白表达水平的缺失或下调，并且这些异常表达与肿瘤的临床病理特征相关，具有重要的临床意义。目前WWOX基因的功能相关研究表明WWOX基因具有抑癌基因的特征，WWOX蛋白可以充当凋亡前体蛋白的角色，WWOX的正常表达对于肿瘤的抑制可能有着重要的意义。 本研究旨在通过检测 WWOX基因在 HCC中的表达情况分析其临床病理意义，并通过体内外实验研究 WWOX基因过表达对肝癌细胞生物学行为的影响，为探讨肝癌的发生发展机制以及寻找肝癌治疗的新思路提供理论依据。 第一部分脆性位点基因WWOX在肝细胞癌中的表达及其临床病理意义 目的：检测 WWOX基因及相关蛋白在 HCC中的表达，并分析其临床病理意义。 方法：应用 RT-PCR和 Western Blot方法在 mRNA及蛋白水平上检测 WWOX在5株肝癌细胞株及 HCC组织中的表达；通过免疫荧光检测 WWOX及 p-WOX在 HepG2细胞中的表达确定其亚细胞定位；通过免疫组织化学染色的方法检测 WWOX、p-WOX、FHIT、Ki-67、Survivin、P53、Bcl-2、Bax及 Cyclin D1蛋白在HCC中的表达，并分析上述蛋白表达的相关性与HCC临床病理参数及患者预后的关系。 结果：WWOX在 Huh-7、Hep3B细胞中高表达，在 HepG2细胞中中等强度表达，在 SK-HEP-1及 MHCC97-H细胞中低表达；免疫荧光检测结果显示WWOX蛋白表达定位于HepG2细胞的细胞质及细胞核；而p-WOX蛋白表达定位于细胞核；WWOX在 HCC实体组织中的表达较之正常肝组织均有下调，尤其是在蛋白表达水平上差异显著（P＜0.05）；免疫组化结果显示51.2%(88/172)的HCC出现WWOX蛋白的低表达，合并肝硬化的HCC组织的WWOX表达水平较之无肝硬化组的表达显著降低（P=0.002）；p-WOX蛋白在 HCC中的表达与肿瘤的组织学分级及分化程度密切相关，随着肿瘤分级的增高及肿瘤分化程度的降低，p-WOX蛋白的表达逐渐升高（P=0.003，P=0.003）；WWOX的表达与Bax的表达呈正相关（P=0.001），与Cyclin D1的表达呈负相关（P=0.009）；而 p-WOX的表达与 Survivin、Bax及 Bcl-2呈正相关（及 P<0.001）；Cox多因素分析显示患者年龄、术前 AFP水平、分化程度、TNM分期、微血管侵犯及Ki-67增殖指数是能够反映肝癌患者术后复发的独立危险因素，其相对危险度分别为2.382(P<0.001)，1.562(P=0.034)，1.448(P=0.023)，2.041(P=0.001)，2.217(P=0.003)及2.111(P<0.001)；患者肿瘤大小、微血管侵犯、术后复发、WWOX表达、p-WOX表达及 Survivin表达是能够反映肝癌患者术后生存期的独立危险因素，其相对危险度分别为2.640(P<0.001)，2.649(P=0.033)，6.232(P<0.001)，0.449(P=0.004)，2.763(P=0.001)及1.719(P=0.050)。 结论：WWOX在肝癌细胞株及HCC组织中的低表达可能促进了HCC肿瘤的发生发展；WWOX及 p-WOX蛋白表达在 HCC肿瘤细胞凋亡及细胞周期的调控中可能发挥重要作用；联合检测 WWOX、p-WOX、FHIT、Ki-67、Survivin、Bcl-2及Bax蛋白有助于我们对患者的术后复发及总生存期进行有效的预测。 第二部分WWOX慢病毒表达载体的构建 目的：构建WWOX慢病毒表达载体，为后续的功能实验研究及以WWOX为靶点的基因治疗奠定基础。 方法：PCR扩增WWOX目的基因，目的基因与GV208载体片段同源重组后转化感受态细胞，用 PCR鉴定转化子，进行阳性克隆测序鉴定，质粒抽提，将WWOX/GV208质粒和包装质粒 pHelper1.0、pHelper2.0共转染293T细胞，包装产生慢病毒颗粒，测定慢病毒滴度。 结果：经 PCR鉴定及测序比对，WWOX目的基因插入序列正确，重组质粒构建成功；包装病毒产生病毒颗粒滴度为2.00E+8 TU/mL。 结论：成功构建了 WWOX基因慢病毒表达载体，为研究其在肝癌细胞中的生物学功能和以其为靶点的基因治疗奠定基础。 第三部分 WWOX基因过表达抑制肝癌细胞增殖的体内外实验研究 目的：观察 WWOX基因过表达对肝癌细胞生物学行为的影响，初步研究WWOX基因在肝癌中的功能机制，并探讨以 WWOX为靶点的基因治疗的可行性。 方法： (1) WWOX慢病毒（LV-WWOX）及空载体病毒（LV-GFP）分别感染人肝癌细胞株 MHCC97-H、SK-HEP-1及 HepG2；MTT法及平板克隆实验分析细胞增殖情况，流式细胞仪检测细胞周期；荧光定量PCR、Western Blot及免疫组织化学等方法检测病毒感染前后各细胞株WWOX、p-WOX、Ki-67、Cyclin D1、Cyclin E、Bax、Bcl-2、EGFR、Procaspase-3及Procaspase-9的表达。 (2)通过形态学观察、MTT法、流式细胞术检测来分析 WWOX过表达对Staurosporine(STS)诱导的 MHCC97-H细胞凋亡敏感性的影响，并通过 Western Blot检测Procaspase-3及Procaspase-9蛋白的表达差异。 (3) WWOX慢病毒（LV-WWOX）及空载体病毒（LV-GFP）分别感染人肝癌细胞株MHCC97-H、SK-HEP-1，随后将上述细胞分别接种于裸鼠皮下构建裸鼠移植瘤模型；剥瘤称重，计算抑瘤率；免疫组织化学染色检测移植瘤组织WWOX、p-WOX、Ki-67、Cyclin D1、Bax及Bcl-2蛋白的表达；采用TUNEL法检测各组肝癌细胞的凋亡情况，计算凋亡指数。 结果： (1) WWOX慢病毒载体能有效感染 HepG2、SK-HEP-1、MHCC97-H细胞，在mRNA和蛋白水平上上调了 WWOX基因的表达；MTT法检测细胞的体外增殖结果显示 WWOX过表达的 MHCC97-H及 SK-HEP-1细胞增殖受到明显抑制；平板克隆实验结果显示 LV-WWOX感染组 SK-HEP-1细胞的克隆形成率较之未感染组及空载体组显著降低；WWOX基因过表达对 HepG2细胞的体外增殖并未显示出明显的抑制作用；流式细胞检测结果显示 WWOX过表达导致MHCC97-H、SK-HEP-1细胞周期阻滞，而 HepG2各组的细胞周期未见明显改变；Real-time PCR、Western Blot及免疫组织化学染色结果显示WWOX过表达MHCC97-H及 SK-HEP-1细胞的 p-WOX蛋白表达增高，并出现核内表达，Ki-67增殖指数降低，细胞周期蛋白cyclinD1、Cyclin E在mRNA和（或）蛋白水平表达降低，凋亡相关蛋白 Bax的 mRNA及蛋白水平表达增高，Bcl-2的mRNA及蛋白表达水平无明显改变，Procaspase-3及 Procaspase-9蛋白的表达显著降低，而上述基因蛋白在WWOX过表达HepG2细胞中无明显变化。 (2) MHCC97-H细胞经 STS处理后，MTT显示 LV-WWOX组细胞的生长抑制率明显高于 LV-GFP组细胞。流式细胞术结果显示 LV-WWOX组细胞的总凋亡率及晚期凋亡率均明显高于LV-GFP组细胞；Western blot结果显示Procaspase-3和Procaspase-9蛋白在LV-WWOX组细胞中的表达下调更加明显。 (3)MHCC97-H(LV-WWOX)组裸鼠肿瘤生长抑制率为52.63%，而SK-HEP-1(LV-WWOX)组裸鼠肿瘤生长抑制率高达90.00%；IHC结果显示两株细胞 LV-WWOX组的 WWOX、p-WOX、Bax蛋白表达均明显高于 LV-GFP组；而 LV-WWOX组的Ki-67、Cyclin D1、Bcl-2的蛋白表达均低于LV-GFP组；LV-WWOX组与LV-GFP组相比肿瘤细胞凋亡指数均显著增加(P<0.01)。 结论： (1) WWOX慢病毒载体介导的 WWOX基因高表达可以抑制 SK-HEP-1及MHCC97-H细胞的体外增殖及裸鼠体内成瘤。 (2)WWOX基因过表达通过下调Cyclin D1和Cyclin E的表达，有效的抑制了SK-HEP-1及MHCC97-H细胞的快速增殖。 (3) WWOX基因过表达促进了 SK-HEP-1及 MHCC97-H细胞的凋亡；WWOX通过蛋白的磷酸化及核内转移参与了凋亡的发生。 (4) WWOX基因过表达可以促进肝癌细胞对Staurosporine诱导凋亡的敏感性。

目录

声明

英文缩略词表

前言

第一部分脆性位点基因WWOX在肝细胞癌中的表达及其临床病理意义

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

第二部分WWOX慢病毒表达载体的构建及鉴定

引言

材料与方法

实验结果

讨论

小结

第三部分WWOX基因过表达抑制肝癌细胞增殖的体内外实验研究

引言

材料与方法

结果

讨论

小结

结论

参考文献

致谢

攻读学位期间完成的论文及课题

综述:染色体脆性位点基因WWOX与肿瘤的研究进展