慢病毒载体(miRNA Sponge)介导miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用机制研究

摘要

目的：构建miR-20a基因的miRNA Sponge载体，建立Jurkat-S稳定细胞株，为进一步研究miR-20a功能及应用干扰技术治疗奠定基础；检测急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达情况并探讨miRNA Sponge介导的miR-17、miR-20a沉默的抗白血病作用机制。
　　方法：设计、合成一对含有2个重复针对miR-20a成熟序列第9-12碱基错配的序列，并带有酶切位点，退火后连接到pCDNA3.0-L表达载体上；载体双酶切后再与退火产物连接，重复4次，酶切及荧光素酶活性鉴定；亚克隆到慢病毒表达载体，与psPAX2、PMD2G共转染HEK293T细胞，包装产生慢病毒颗粒并测定病毒滴度，感染高表达miR-17、miR-20a的Jurkat细胞株；应用real-time PCR和Western blot技术分别检测Jurkat-S稳定细胞中P21及E2F1 mRNA和蛋白水平的表达，并与对照组进行比较；CCK-8方法及流式细胞仪方法分别检测miR-17、miR-20a沉默对Jurkat细胞增殖能力及细胞周期的影响。采用real-time PCR方法检测初治急性白血病患者及白血病细胞株中miR-17、miR-20a前体的表达水平，分析其在各型白血病中的表达情况。
　　结果:成功构建针对miR-20a基因的Sponge载体，病毒滴度为5×107TU/ml；建立稳定转染的Jurkat-S细胞株，有效干扰验证显示miR-20a Sponge能明显上调P21及E2F1的mRNA及蛋白水平，差异有统计学意义(p<0.05)；初治急性白血病患者中miR-17、miR-20a前体的表达明显高于正常对照(p<0.05)；且与急性髓系白血病患者相比，急性淋巴细胞白血病患者中的表达量更高；然而二者表达量与患者外周血白细胞水平无明显相关性(p>0.05)；miR-17、miR-20a沉默能抑制Jurkat细胞的增殖，且导致细胞周期阻滞于G1-S期。
　　结论：成功构建miR-20a基因的miRNA Sponge载体，建立稳定干扰miR-20a表达的Jurkat-S细胞株。急性白血病患者中miR-17、miR-20a呈过表达，可能参与白血病的发生、发展；高表达的miR-17、miR-20a可通过在转录后抑制P21、E2F1表达,从而促进细胞增殖及细胞周期G1-S期转换。

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前言

第一部分miR-20a Sponge载体构建及在白血病细胞株Jurkat中的表达

1 .1 引言

1 .2材料

1 .3方法

1 .4结果

1 .5 讨论

1 .6 结论

第二部分miRNA Sponge介导的miR-17、miR-20a基因沉默的抗白血病作用

2 .1 引言

2 .2 材料

2 .3方法

2 .4 结果

2 .5 讨论

2 .6 结论

总结

参考文献

DNA甲基化-microRNA在多发性骨髓瘤中的研究进展

1.DNA甲基化与microRNA

2.甲基化-miRNA网络与骨髓瘤

3.MM中DNA甲基化与异常表达miRNAs

4.MM中miRNA调控DNA甲基化

5. 结语与展望

参考文献：

致谢