芪蓝制剂对人舌鳞癌Tca8113细胞的抗增殖和促凋亡作用的机制研究

摘要

目的：复方中药芪蓝制剂由黄芪、绞股蓝、川芎和富硒绿茶配方而成，具有“健脾益气、活血祛瘀、解毒止痛”之功效，可用于口腔某些疾病的防治。本研究采用芪蓝制剂体外作用于人舌鳞癌细胞系 Tca8113细胞，通过观察芪蓝制剂对其增殖、细胞周期分布及凋亡等生物学行为的作用效应，并探究其作用效应与microRNA-21（miR-21）及其靶蛋白PTEN和PDCD4的关系。
　　方法：以体外培养人舌鳞癌系Tca8113细胞为模型，用1.56~25mg/mL梯度浓度芪蓝制剂处理Tca8113细胞12 h、24 h、48 h，以等体积不含芪蓝制剂的基础培养基处理相同时间为空白对照组，cell counting kit-8（CCK8）法检测细胞活力改变，流式细胞仪检测细胞周期分布及细胞凋亡率，特异性茎环状引物结合Taqman探针实时荧光定量PCR法检测miR-21的相对表达量变化，以Western blot检测PDCD4和PTEN蛋白的相对表达量变化。Lipofectamine?3000瞬时转染miR-21 mimic使Tca8113细胞过表达miR-21，芪蓝制剂继续处理24 h后，应用相同的方法检测细胞活力、细胞周期分布和细胞凋亡率，以及miR-21和PDCD4蛋白的相对表达量。
　　结果：
　　1.芪蓝制剂作用于Tca8113细胞后，CCK-8法结果显示与空白对照组相比，1.56~25 mg/mL范围浓度药物对其细胞活性均有抑制作用（P<0.05），且呈剂量依赖性，12h、24h及48h的IC50分别为8.800 mg/mL、6.131 mg/mL、3.628 mg/mL，其体外增殖抑制作用随干预时间的延长逐渐增强；
　　2.与空白对照组相比，不同浓度芪蓝制剂作用于 Tca8113细胞12h或24h后，S期细胞比例显著升高（P<0.05），G0/G1期细胞比例显著下降（P<0.05），G2/M期细胞比例无明显变化（P>0.05）；
　　3.与空白对照组（4.71±1.65％）相比，3.12~25 mg/mL范围浓度芪蓝制剂作用于Tca8113细胞24h后，出现明显凋亡细胞群（15.04±1.67%至69.74±4.63%，P<0.05）；
　　4.与空白对照组相比，3.12~25 mg/mL范围浓度芪蓝制剂作用 Tca8113细胞24h后，miR-21的相对表达量显著下调（P<0.05）；
　　5.与空白对照组相比，不同浓度芪蓝制剂作用Tca8113细胞24h后，均明显上调PDCD4和PTEN蛋白的相对表达量（P<0.05），且在6.25mg/mL浓度下，PDCD4表达量最高（2.48±0.12倍），在12.5 mg/mL浓度下，PTEN表达量最高（1.51±0.06倍）；
　　6.设置不同比例的Lipofectamine?3000试剂与FAM-NC RNA用量，瞬时转染24 h后，利用流式细胞仪检测各组细胞带绿色荧光的比例及其平均荧光强度，结果显示在Lipofectamine?3000:FAM-NC RNA=4.5μL:60nM比例下转染效率最高；
　　7.利用Lipofectamine?3000瞬时转染miR-21 mimic，构建miR-21过表达Tca8113细胞模型，再应用6.25mg/mL芪蓝制剂处理24h，qRT-PCR结果显示miR-21+Qilan组中miR-21的表达量相对于NC RNA和NC RNA+Qilan组分别上调14倍和30倍（P<0.05）；CCK-8实验和流式细胞仪检测结果显示过表达miR-21部分降低芪蓝制剂的抗增殖和促凋亡效应，与 NC RNA+Qilan组（55.75±3.63%）相比，miR-21+Qilan组细胞活性增至71.08±8.72%，但仍低于NC RNA组（97.83±5.63%，P<0.05），而细胞凋亡率从NC RNA+Qilan组的22.72±1.52%降至13.27±0.44%，但仍高于NC RNA组（P<0.05）；与之相似，Western blot结果显示miR-21+Qilan组PDCD4的表达量介于NC RNA+Qilan组和NC RNA组之间（P<0.05）；相反地，流式细胞仪检测结果显示过表达miR-21对芪蓝制剂的S期周期阻滞效应无明显影响（P>0.05）。
　　结论：
　　1.芪蓝制剂对人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞发挥抗增殖和促凋亡作用；
　　2.芪蓝制剂对人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞发挥S期周期阻滞作用；
　　3.芪蓝制剂下调miR-21的表达，并上调其靶蛋白PDCD4和PTEN的表达；
　　4.芪蓝制剂通过miR-21/PDCD4通路发挥对人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞的抗增殖和促凋亡作用；
　　5. miR-21/PDCD4通路可能不参与芪蓝制剂对人舌鳞癌细胞系Tca8113细胞的S期周期阻滞作用。

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声明

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中文摘要

英文摘要

前言

材料方法

1 实验材料与试剂

2 主要溶液配制

3 主要实验仪器设备

4 实验方法

结果

1 芪蓝制剂分别干预Tca8113细胞12h、24h、48h后细胞活力的变化结果

2 芪蓝制剂对Tca8113细胞凋亡的影响结果

3 芪蓝制剂对Tca8113细胞周期分布影响结果

4 芪蓝制剂对Tca8113细胞miR-21 表达的影响结果

5 芪蓝制剂对Tca8113细胞PDCD4和PTEN蛋白表达的影响结果

6 脂质体转染条件优化实验结果

7 过表达miR-21对芪蓝制剂作用效应的影响

讨论

1 芪蓝制剂对Tca8113细胞发挥抗增殖和促凋亡作用

2 芪蓝制剂对Tca8113细胞发挥S期周期阻滞作用

3 芪蓝制剂下调 Tca8113 细胞 miR-21 的表达并上调其靶蛋白PTEN/PDCD4的表达

4 过表达miR-21部分降低芪蓝制剂的作用效应

5 过表达miR-21不影响芪蓝制剂的S期周期阻滞效应

结论

参考文献

综述：microRNA对口腔鳞癌发生发展线性调控机制的研究进展

致谢