两种新型抗抑郁候选新药的抗抑郁效应评价以及作用机制

摘要

抑郁症具有高发病、高自杀、高复发、高致残特点，而识别率、就诊率、治疗率却较低，其防治成为全球严重的公共卫生问题和突出的社会问题。目前临床上用于治疗抑郁症的常用药物选择性NE再摄取抑制剂和/或选择性5-HT再摄取抑制剂（SSRI）虽然具有一定的疗效，但毒副作用严重。因此,亟待研发基于新靶标的新型抗抑郁药物。 转位蛋白18kDa（TSPO）是由五个位于线粒体外膜的跨膜蛋白组成的。TSPO在大脑主要存在于神经胶质细胞，与配体结合后可促进胆固醇转运入线粒体膜内，从而促进脑内神经类固醇合成。神经类固醇在人类情绪和应激反应调节中发挥重要作用，在抑郁、焦虑等精神系统疾病的治疗中表现出潜在的应用价值。人们注意到，日本三共制药公司研制了TSPO的特异性配体AC-5216，发现其在动物模型上具有显著的抗抑郁、抗焦虑效应，且没有镇静、肌松、认知损伤、戒断、耐受等安定样副作用，目前正处于Ⅱ期临床试验阶段。 然而，AC-5216具有难溶于水的不足，生物利用度也较低，且该化合物结构优化空间较大。据此，军事医学科学院毒物药物研究所药物化学研究室根据TSPO配体 AC-5216进行了结构改造，合成结构全新系列水溶性衍生物，遴选了新化合物 YL-IPA08。军事医学科学院毒物药物研究所前期工作提示，YL-IPA08较之于AC-5216，该化合物与TSPO具有更高的亲和力、更强的选择性；在动物模型上，预实验提示其具有显著的抗抑郁效应，且无肌松、镇静、损伤认知等安定样不良反应；YL-IPA08生物利用度高（78%），以原型入脑。因此，YL-IPA08具有良好的成药性。然而，YL-IPA08抗抑郁效应有待于全面评价，其抗抑郁机制有待深入系统探索，以期为其开发成为具有我国自主知识产权的新型抗抑郁症药物提供科学依据和理论基础。 基于中医中药临床治疗有效性，从中药有效成分筛选抗抑郁症药物，这是我国开发抗抑郁症新药的重要方向与途径。白芍为毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall.的根，性味苦、酸，微寒，归肝、脾经，具有养血敛阴、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，主治血虚阴亏、肝阳偏亢及胁肋疼痛、脘腹四肢拘挛作痛诸证。白芍常用于一些中药复方制剂中如四逆散、逍遥散治疗抑郁样情绪失调。芍药苷和芍药内酯苷为白芍的主要活性成分。有报道，白芍活性成分芍药苷具有抗抑郁作用。然而，白芍活性成分芍药内酯苷抗抑郁作用及其机制有待研究，以期从中药白芍寻找新型的抗抑郁症药物。 基于上述情况，笔者作为福建医科大学与军事医学科学院毒物药物研究所联合培养的研究生，在军事医学科学院毒物药物研究所进行了新型18kD转位蛋白（TSPO）配体 YL-IPA08的抗抑郁效应及其作用机制、白芍提取物芍药内酯苷的抗抑郁效应及其作用机制研究。本论文主要研究内容包括2个部分：1.新型18kD转位蛋白（TSPO）配体YL-IPA08的抗抑郁效应及其作用机制；2.白芍提取物芍药内酯苷的抗抑郁效应及其作用机制。 第一部分新型18kD转位蛋白（TSPO）配体YL-IPA08的抗抑郁效应及其作用机制 抑郁症病因不明，与遗传、生物化学、社会、心理、文化等多种因素有关。抑郁症发病机制复杂，其发生可能与脑内单胺类神经功能失衡、下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴过度活化、脑源性神经营养因子（BDNF）低下等因素有关，而 HPA轴过度活化可导致脑内海马神经元坏死、减少。临床的抗抑郁药多数是通过调节脑内单胺类神经功能、抑制HPA轴并增加神经营养与可塑性等机制来发挥治疗抑郁症的作用。神经营养与可塑性（主要由 BDNF等因子介导）受不同的信号转导通路调控，主要包括环磷酸腺苷（cAMP）通路、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路和钙调素依赖蛋白激酶（CaMK）通路，激活这些通路后最终可以磷酸化环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB），调节BDNF等基因表达，从而影响神经元存活、神经元再生等可塑性改变。本部分研究首先在经典抑郁模型-慢性应激大鼠模型上，较为全面评价 YL-IPA08的抗抑郁效应；进而从 TSPO作用靶点入手，研究其对TSPO表达及其下游神经类固醇合成的影响；最后，从神经元再生和神经可塑性、HPA轴、cAMP通路等角度，较为系统分析YL-IPA08抗抑郁作用的可能机制。主要研究内容如下： 1. YL-IPA08重复给药对慢性应激(CUS)大鼠行为学的影响 根据糖水偏嗜度基线把大鼠随机分为对照组、模型组、阳性药 AC-5216（0.3 mg/kg）组和YL-IPA08低、中、高剂量（0.1，0.3和1.0 mg/kg）处理组。连续5周以每天1次的频率给予大鼠一系列不可预知的应激刺激以建立慢性应激模型，对照组不给予任何刺激和药物，模型组或给药组在每次刺激前1小时灌胃给予溶剂或阳性药AC-5216或YL-IPA080.1，0.3和1.0 mg/kg，每天1次，连续给药35天。在第35天进行糖水偏好试验，第37天进行开场活动测试，第39天进行新奇抑制摄食测试，第41天进行高架十字迷宫实验。探讨YL-IPA08在慢性应激大鼠抑郁模型上是否具有抗抑郁作用和抗焦虑作用。结果表明，慢性应激导致大鼠糖水偏嗜度降低、开场活动中平行运动次数和垂直运动次数减少、摄食潜伏期延长及高架十字迷宫中开臂次数比例和开臂时间比例减少，表现为“抑郁和焦虑样行为”，灌胃给予AC-5216后可逆转这些作用；灌胃给予YL-IPA08可显著升高大鼠糖水偏嗜度，增加开场水平运动次数和垂直运动次数，缩短大鼠摄食潜伏期，增加大鼠进入开臂次数和进入开臂时间的比例，提示YL-IPA08具有显著的抗抑郁效应。 2.YL-IPA08抗抑郁作用机制分析 行为学实验后，每组部分大鼠心脏灌流后取全脑切片进行免疫荧光检测，部分大鼠取全脑切片进行高尔基染色实验，剩余所有大鼠取血取脑并分离海马和前额皮层，进行下述的机制研究。 采用蛋白质分子印迹法（Western Blot）法检测大鼠海马区TSPO、p-CREB和BDNF的表达，评价YL-IPA08行为效应与TSPO、p-CREB和BDNF表达的关系；用酶联免疫吸附法（ELISA）法检测大鼠血清、海马和前额皮层孕酮、四氢孕酮和5α-还原酶的含量，评价YL-IPA08的抗抑郁作用与TSPO下游神经类固醇的合成量及其合成酶的关系；用 ELISA法检测大鼠血清促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质酮（CORT）的含量，评价YL-IPA08的抗抑郁作用与HPA轴的关系；用ELISA法检测大鼠海马和前额皮层 cAMP含量，评价 YL-IPA08的抗抑郁作用与脑区cAMP含量的关系；用免疫荧光染色法检测大鼠脑海马区BrdU阳性细胞表达量的影响，用高尔基染色法检测大鼠脑海马区椎体细胞树突总长度和分支节的影响，分析YL-IPA08抗抑郁作用与大鼠神经元再生和神经结构复杂性的关系。 结果表明，慢性应激组大鼠海马区TSPO、p-CREB和BDNF表达明显减少，伴随给予 YL-IPA083个剂量组和阳性对照组 AC-5216均能逆转这种改变，提示YL-IPA08的抗抑郁作用与大鼠海马区TSPO、p-CREB和BDNF的表达升高有关。慢性应激组大鼠血清孕酮显著升高，而海马和前额皮层脑区孕酮显著降低，伴随给予YL-IPA083个剂量组和阳性对照组AC-5216均能逆转这种改变，慢性应激组血清、海马和前额皮层脑区四氢孕酮含量显著降低，伴随给予YL-IPA083个剂量组和阳性对照组AC-5216均能逆转这种改变，提示YL-IPA08抗抑郁作用与大鼠海马和前额皮层脑区类固醇水平上调有关。慢性应激大鼠血清中ACTH和CORT含量显著升高，YL-IPA080.3-1.0 mg/kg剂量经过5周灌胃给药后可显著下调ACTH的含量，YL-IPA080.1 mg/kg剂量组虽然不能显著降低ACTH的量，但也有降低的趋势，同时YL-IPA083个剂量组均可显著下调CORT的含量，提示YL-IPA08抗抑郁作用与其抑制HPA轴有关，作用与阳性药相当。慢性应激组大鼠海马和前额皮层脑区cAMP显著降低，伴随给予YL-IPA08和阳性对照组AC-5216均能逆转这种改变，提示YL-IPA08抗抑郁作用与大鼠脑区cAMP含量增加有关。 免疫荧光染色结果显示，慢性应激模型组大鼠海马BrdU阳性细胞显著减少，伴随给予YL-IPA083个剂量组和阳性对照组AC-5216均能逆转这种改变；高尔基染色结果显示，慢性应激模型组大鼠海马区锥体细胞树突总长度和分支节点明显缩短和减少，伴随给予YL-IPA083个剂量组和阳性对照组AC-5216均能逆转这种改变。上述结果提示，YL-IPA08抗抑郁作用与其促进脑内神经元再生和改变神经结构复杂性有关。 综上提示，YL-IPA08具有显著的抗抑郁效应，其作用机制可能涉及：1.作用于TSPO，促进神经类固醇的合成；2.抑制HPA轴的活性；3.增强cAMP-CREB-BDNF通路的作用；4.增强脑内神经元的再生和神经可塑性。 第二部分白芍提取物芍药内酯苷的抗抑郁效应及其作用机制 抑郁症发病机制复杂，大量研究资料表明影响脑内单胺递质是抗抑郁作用的重要机制。单胺学说认为5-羟色胺（5-HT）、去甲肾上腺素（NE）和多巴胺（DA）是影响抑郁症的重要因素。目前临床常用的抗抑郁药如5-HT和/或NE重摄取抑制剂的作用机制都与其影响脑内单胺递质有关。脑源性神经营养因子（BDNF）是一种神经生长因子，它主要存在于中枢神经系统并维持其功能，提高BDNF的水平可发挥抗抑郁作用。鉴此，本部分拟首先在小鼠绝望抑郁模型和大鼠慢性应激模型上确证白芍活性成分芍药内酯苷的抗抑郁效应；进而，从大脑海马单胺递质的含量和BDNF的表达角度，探讨白芍活性成分芍药内酯苷抗抑郁的作用机制。主要研究内容如下： 1.芍药内酯苷对小鼠、大鼠抑郁模型的抗抑郁效应 小鼠按体重随机分为对照组、阳性药盐酸氟西汀组、芍药内酯苷（3.5，7.0和14.0 mg/kg）剂量处理组。连续7d灌胃给予双蒸水、阳性药盐酸氟西汀和芍药内酯苷3个剂量组后进行小鼠悬尾、强迫游泳和自发活动测试，每种测试之间间隔1天，观察其抗抑郁效应。结果显示，在小鼠悬尾和强迫游泳中发现盐酸氟西汀和芍药内酯苷3个剂量都能够明显缩短小鼠悬尾不动时间和游泳不动时间，同时不影响小鼠自发活动，提示芍药内酯苷在小鼠绝望模型上具有抗抑郁效应。 大鼠根据糖水偏嗜度随机分为对照组、模型组、阳性药盐酸氟西汀对照组、芍药内酯苷（3.5，7.0和14.0 mg/kg）剂量处理组。连续5周以每日1次的频率给予大鼠一系列不可预知的应激刺激以建立慢性应激模型，对照组不给予任何刺激和药物，其他组每次刺激前分别灌胃给予双蒸水、阳性药盐酸氟西汀或芍药内酯苷3个剂量组，在应激结束后检测大鼠糖水偏嗜度和开场活动。结果显示，慢性应激导致大鼠糖水偏嗜度降低、开场活动中平行和水平活动次数明显减少，伴随给予芍药内酯苷和阳性对照组盐酸氟西汀均能逆转这种改变，提示，芍药内酯苷在慢性应激大鼠抑郁模型上有抗抑郁效应。 2.芍药内酯苷抗抑郁的作用机制 行为学测试后，小鼠、大鼠迅速取脑并分离海马。Western Blot法检测小鼠、大鼠海马BDNF表达，探讨芍药内酯苷抗抑郁作用与海马区BDNF水平的关系；高效液相法（HPLC-ECD）检测海马区多巴胺（DA）、3，4-二羟基苯乙酸（DOPAC）、5羟色胺（5-HT）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）、肾上腺素（AD）、高香酸（HVA）和去甲肾上腺素（NE）的含量，分析芍药内酯苷抗抑郁作用与脑内单胺递质及其代谢产物水平的关系。 结果表明，盐酸氟西汀和芍药内酯苷3个剂量组灌胃给药7d在产生抗抑郁效应的同时可显著升高海马BDNF水平。慢性应激导致大鼠海马区BDNF水平显著降低；5周连续灌胃给予芍药内酯苷3个剂量组和阳性对照组盐酸氟西汀均能逆转这种改变，提示芍药

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中英文缩略词表

第一部分 新型18kD转位蛋白（TSPO）配体YL-IPA08的抗抑郁效应及其作用机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

第二部分 白芍提取物芍药内酯苷的抗抑郁效应及其作用机制

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述:四氢孕酮在抑郁与焦虑中的调控作用

致谢