γδT细胞用于多发性骨髓瘤免疫治疗的实验研究

摘要

目的：
　　研究γδT细胞对MM（multiple myeloma，骨髓瘤）细胞的杀伤作用和对 imDCs（immature dendritic cells，未成熟树突状细胞）转分化为 OCs（osteoclast cells，破骨细胞）的抑制作用。
　　方法：
　　（1）采集健康志愿者外周血，经淋巴细胞分离获得PBMNCs（peripheralblood mononuclear cells，外周血单个核细胞），并在1μM Zol（zoledronate，唑来膦酸）和200 IU/ml rhIL-2（recombinant human interleukin-2，重组人白介素-2）的条件下扩增获得γδT细胞，免疫磁珠法分选培养至第7天的γδT细胞；
　　（2）收集生长状态良好的MM8226细胞株，与磁珠分选获得的γδT细胞共培养4小时，通过LDH（lactate dehydrogenase，乳酸脱氢酶）法检测γδT细胞对MM8226细胞株的杀伤作用；并比较分别用10μg/ml抗人γδ TCR mAb（monoclonal antibody，单克隆抗体）、抗人NKG2D mAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封闭后的γδT细胞对MM8226细胞株的杀伤作用；
　　（3）免疫磁珠法分选获得CD14+单个核细胞，在rhIL-4（recombinant human interleukin-4，重组人白介素-4）和GM-CSF（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子）的作用下分化为 imDCs，后者在M-CSF（macrophage colony stimulating factor，巨噬细胞集落刺激因子）和sRANKL（soluble nuclear factor kappa B predominate ligand receptor activation factors，可溶性细胞核因子κB受体活化因子配体）共同作用下转分化为具有骨吸收作用的OCs；
　　（4）免疫磁珠分选获得的γδT细胞与CD14+单个核细胞经imDCs途径转分化为OCs的各个阶段，通过直接和间接接触的方式以不同比例共培养至第14天，通过TRAP（tartrate-resistant acid phosphatase，抗酒石酸酸性磷酸酶）染色观察γδT细胞对OCs生成数量的影响；
　　（5）将抗体封闭后的γδT细胞与imDCs以10:1的比例直接共培养至第14天，通过TRAP染色观察生成OCs的情况；
　　（6）收集不同培养组上清液，通过ELISA方法检测不同阶段、不同比例上清液中IFN-γ（interferon-γ，干扰素-γ）和CTX-I（Type I collagen end Carboxy-terminal peptide，I型胶原C-末端肽）浓度变化。
　　结果：
　　（1）证实体外条件下可通过Zol和IL-2扩增获得γδT细胞；
　　（2）γδT细胞与MM8226细胞株按效靶比为10:1、1:1、1:10混合培养4小时，γδT细胞对其杀伤率分别为41.69％、26.88%、9.97%，显示γδT细胞对MM细胞具有杀伤作用，且呈剂量依赖性；分别用抗人γδTCR mAb、抗人NKG2DmAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封闭γδT细胞后，将γδT细胞与MM8226细胞株按10:1的效靶比混合培养时，各组杀伤率分别为21.56%、26.86%、14.93%、42.03%，显示TCR-γδ途径被阻断后，γδ T细胞对MM8226细胞株的杀伤力减低，且比NKG2D途径阻断后的杀伤率减低更明显；
　　（3）γδT细胞与CD14+PBMNCs直接共培养组中基本见不到TRAP染色阳性细胞；间接共培养组中，当两者比例为1:5时，TRAP染色阳性多核巨细胞数为8.33±2.08（- x±S）个/10个视野，远低于CD14+PBMNCs单独培养组（37.67±2.05个/10个视野）（p<0.05）；γδT细胞与imDCs直接共培养组中，两者比例分别为1:10、1:1、10:1时，TRAP染色阳性的多核巨细胞数目分别为14.33±2.08个/10个视野、9.67±2.52个/10个视野、3.33±1.53个/10个视野，各组之间以及与imDCs单独培养组（37.67±2.05个/10个视野）之间比较，OCs均生成减少（p值均小于0.05），差异具有统计学意义；而在γδT细胞与imDCs间接共培养组中，两者比例分别为1:10、1:1、10:1时，TRAP染色阳性的多核巨细胞数目分别为24.67±2.08个/10个视野、15.53±1.33个/10个视野、7.67±0.58个/10个视野，各组与imDCs单独培养组之间差异亦具有统计学意义（p值均小于0.05）；γδT细胞与OCs直接或间接共培养组中，均可见到已经生成的OCs被溶解、皱缩，并显示相同比例的两种细胞共培养，直接混合培养相对间接共培养，γδT细胞对各个阶段的抑制作用更明显；并且，γδT细胞对imDCs转分化为OCs过程中的抑制作用呈剂量依赖性，随着γδT细胞比例的增高，其抑制作用相对更明显；
　　（4）抗人γδTCR mAb、抗人NKG2D mAb、抗人γδTCR mAb+抗人NKG2D mAb及抗鼠IgG mAb封闭后的γδT细胞与imDCs以10:1直接共培养时，TRAP染色阳性的多核巨细胞数目（2.33±0.47个/10个视野）并未比相同比例的无抗体封闭培养组（3.33±1.53个/10个视野）数目增加，显示抗体封闭并未对γδT细胞抑制OCs生成的过程产生影响（p>0.05）；
　　（5）γδT细胞与imDCs共培养比例分别为1:1、5:1、10:1时，培养24小时后直接共培养组上清中IFN-γ的浓度分别为617.09 pg/ml、900.1 pg/ml、1277.34 pg/ml，间接共培养组浓度分别为509.68pg/ml、786.49 pg/ml、1045.5 pg/ml。显示随着γδT细胞比例的增高，其分泌IFN-γ的能力亦随之增高，且 imDCs与γδT细胞直接共培养相对间接共培养来说，imDCs刺激γδT细胞分泌IFN-γ的能力更明显；当两种细胞比例为1:1时，γδT细胞与CD14+单个核细胞共培养时，CTX-I基本不分泌；与imDCs以1:1比例共培养时，直接接触共培养上清液中CTX-I的水平（397.01 pg/ml）低于间接接触共培养组（459.47 pg/ml）；γδT细胞与OCs作用24小时后，直接共培养组上清液中检测不到CTX-I，间接组的水平（83.245 pg/ml）低于OCs单独培养组（889.54 pg/ml），差异具有统计学意义（p<0.05）。
　　结论：
　　（1）体外培养条件下，γδT细胞具有杀伤MM细胞的作用，其机制可能与其表面TCR和NKG2D受体介导的信号通路有关；
　　（2）γδT细胞可在OCs分化发育的各个阶段抑制OCs的生成并溶解成熟OCs，其抑制作用的机制并不与细胞表面TCR和NKG2D受体介导的途径有关；
　　（3）IFN-γ可能在γδT细胞抑制OCs生成的过程中发挥作用。因此，γδT细胞有希望成为MM细胞免疫治疗的一种选择。

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英文缩略词（Abbreviation）

中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

一、材料

二、方法

结果

1γδT细胞的体外扩增

2γδT细胞的细胞毒活性检测结果

3 破骨细胞的体外培养

4 γδ T细胞与CD14+外周血单个核细胞经由imDC途径转分化为OC过程中不同分化阶段通过直接或间接接触共培养，观察γδT细胞对OC分化过程中的影响

5 观察抗体封闭γδT细胞后，其对imDC分化为OC的影响

6 ELISA方法比较不同培养组细胞因子水平

讨论

1γδT细胞对MM细胞的毒性作用及机制探讨

2γδT细胞对imDC转分化为OC过程的影响

3γδT细胞抑制OC生成的机制

4γδT细胞对成熟OC的影响

5 IFN-γ在γδT细胞抑制OC生成过程中的作用探讨

结论

参考文献

综述:Vγ9Vδ2 T细胞免疫治疗研究现状及进展

致谢