结肠癌耐奥沙利铂细胞株的建立、转录组学分析及耐药性逆转

摘要

结直肠癌为世界第三大常见肿瘤，多数早期患者可通过手术治愈，而晚期复发转移患者的预后不良，5年生存率低，严重威胁患者的生命。奥沙利铂（L-OHP）是推荐的经典一线化疗药物，可提高患者5年生存率及生存质量，但仍有许多患者对该化疗药物不敏感，或者在治疗期间出现耐药，使其疗效受到严重影响，因此对L-OHP耐药机制的研究已成为临床上亟待解决的问题。 为了研究结直肠癌患者对L-OHP产生耐药的机制，本研究通过L-OHP大剂量间断冲击结合逐步递增药物浓度的方法培养建立了人结肠癌奥沙利铂耐药细胞模型（HCT-8/L-OHP）；采用Illumina测序技术对人结肠癌细胞HCT-8及耐奥沙利铂结肠癌细胞HCT-8/L-OHP的转录组进行测序，筛选出差异表达基因并进行GO和KEGG富集分析；同时分析KLK11基因在HCT-8细胞及HCT-8/L-OHP细胞中的差异表达情况；最后采用RNA干扰（RNA interferece，RNAi）技术，构建KLK11小干扰 RNA（KLK11-siRNA）的慢病毒表达载体，沉默耐药细胞株的KLK11基因，验证其是否可逆转细胞耐药性，从而在细胞分子水平探索KLK11基因的表达情况与L-OHP耐药的相关性。基于以上目的，我们将研究分为以下三个部分： 第一部分人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-8/L-OHP的建立和鉴定 目的：建立人结肠癌耐奥沙利铂细胞株，为寻找与化疗耐药相关的靶分子和探索L-OHP耐药机制的研究奠定基础。方法：本部分研究采用L-OHP大剂量间断冲击结合逐步递增药物浓度的方法培养建立人结肠癌L-OHP耐药细胞模型即HCT-8/L-OHP。采用MTT法鉴定所建立耐药细胞株的药敏性，并检测耐药细胞株对多种抗癌药物的多药耐药特征及亲本细胞和耐药细胞的生长曲线和细胞群体倍增时间；用光镜、电镜、流式细胞仪（FCM）等方法观察亲本细胞和耐药细胞的形态和其周期分布及细胞的凋亡情况；采用 RT-PCR方法检测ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1（P-gp），GSTP1，ERCC1，KLK11、ANPEP，HOXB8等基因表达情况。结果：建成了L-OHP耐药细胞模型—HCT-8/L-OHP，其耐药性能稳定，IC50为58.21μmol/L，RI为10.07；HCT-8细胞形态发生变化、代谢率降低，生物活力减弱；HCT-8/L-OHP细胞不仅对 L-OHP产生耐药性，而且对5-氟尿嘧啶、顺铂、长春新碱、伊立替康等也有不同程度的耐药性，具有多药耐药特征；与亲本细胞株相比，耐药株对数生长期的细胞增殖速度变慢；采用FCM分析显示HCT-8/L-OHP细胞在G2/M期所占细胞比例增多，在S期及G0/G1期所占细胞比例减少，差异有统计学意义（?2=10.90，P＜0.01）；HCT-8/L-OHP细胞早期和晚期的总凋亡率低于 HCT-8细胞；ABCC1(MRP or MRP1)，ABCB1（P-gp）等耐药相关基因在耐药细胞株中高表达。结论：成功构建了人结肠癌耐药细胞模型 HCT-8/L-OHP，其耐药性稳定并具有多药耐药性，另外ABCC1(MRP or MRP1)、ABCB1（P-gp）、ERCC1、KLK11、ANPEP、HOXB8等基因表达升高可能是奥沙利铂耐药的分子机制。 第二部分人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-8的差异基因研究 目的：筛选出差异表达基因，并进一步对有显著差异表达的耐奥沙利铂相关基因进行分析，从而为研究奥沙利铂的耐药机制提供线索及理论参考。方法：首先利用Trizol Kit等技术提取RNA，并将cDNA片段通过PCR扩增；其次通过Illumina测序平台构建人结肠癌细胞HCT-8及耐奥沙利铂结肠癌细胞HCT-8/L-OHP的转录组测序文库，使用建好的文库将扩增后的cDNA上机测序，应用Trinity程序对转录组进行整合及de novo组装；最后使用Blast2GO和WEGO软件进行GO分析和基因功能注释。单独分析KLK11基因在转录组测序中的表达差异，并采用RT-PCR的方法检测KLK11在亲本细胞和耐药细胞的表达情况。结果：HCT-8细胞株与HCT-8/L-OHP细胞株比较，以FDR≤0.05以及|log2 Ratio|≥1进行差异表达基因筛选，共筛选出差异表达基因1829个，其中表达上调、下调的分别为922、907个。差异表达的基因富集包括新陈代谢、生物调控等39个生物学过程（Biological Process），酶催化活性调控、应激应答等35个分子功能（Moleculer Function）及细胞连接、膜功能等16个细胞组成（Cellular Component）。将35.9%（21个）差异表达基因名Map到KEGG数据库中发现最大的富集度通路是与癌症相关的通路，共56个差异表达基因。此外，富集通路还包括P53信号通路，细胞周期，碱基错配修复等。KLK11基因在转录组测序中的表达差异分析结果显示HCT-8/L-OHP中KLK11基因的表达明显高于亲本株。进一步采用RT-PCR方法检测显示耐药细胞HCT-8/L-OHP KLK11 mRNA表达上调，与亲本细胞HCT-8比较，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论：成功筛选出了HCT-8细胞和HCT-8/L-OHP差异表达基因；其次，结肠癌细胞对L-OHP的耐药性可能与癌症发生相关的通路、P53信号通路、细胞周期通路及碱基错配修复通路等这些参与癌症治疗耐药机制及逆转的相关通路有关；化疗耐药与DNA损伤修复通路中的MGMT、RFC5、PRIM1、 MCM7、 POLE、MCM3、 MCM4、FEN1、MCM6等基因的表达有关。另外，发现KLK11的高表达可能与奥沙利铂的耐药性有关。 第三部分KLK11-si RNA慢病毒表达载体的构建对结肠癌耐药细胞株的逆转作用 目的：构建以KLK11为靶基因的慢病毒干扰载体，建立KLK11缺陷型细胞株，验证沉默KLK11基因对结肠癌耐药细胞株耐药性逆转的作用。方法：根据shRNA设计原则，针对靶基因KLK11设计了3条干扰片段，构建相应的慢病毒表达载体，通过菌液PCR和测序鉴定重组质粒及荧光法和药筛法确定最佳病毒滴度；将三个慢病毒载体根据其最佳病毒滴度感染HCT-8/L-OHP细胞建立KLK11缺陷型细胞株；用RT-PCR检测干扰后HCT-8/L-OHP细胞KLK11基因的表达情况，筛选出干扰、抑制效率最高的KLK11-siRAN；采用Western blotting检测抑制效率最高的KLK11-siRNA对KLK11基因蛋白表达的影响；用MTT法测定KLK11-siRNA联合化疗药物奥沙利铂对HCT-8/L-OHP的增殖抑制作用；利用FCM分析KLK11-siRNA感染HCT-8/L-OHP细胞前后的细胞周期分布情况。结果：合成的3组干扰序列成功插入GV248载体中，重组质粒的构建成功；三组病毒载体均成功感染293T细胞，且感染率均达80%以上，3组慢病毒表达载体的最佳病毒液滴度分别为3×108TU/mL（LV-KLK11-RNAi(41637-1)），5×108 TU/mL（LV-KLK11-RNAi(41638-1)），1×109TU/mL（LV-KLK11-RNAi(41640-1)）；与CON细胞组比较，所有的KLK11干扰组细胞均表现为GFP阳性，感染效率几乎达到100%。与对照组 HCT-8/L-OHP细胞及阴性对照组细胞比较，KLK11-RNAi(41637-1)、KLK11-RNAi(41638-1)、KLK11-RNAi(41640-1)3个靶点在HCT-8/L-OHP细胞中对KLK11基因的表达均有显著的抑制效果（P＜0.01），其中，KLK11-RNAi(41638-1)组细胞KLK11 mRNA的表达量最低，其敲减效率则最高，达92.3%。KLK11-RNAi(41638-1)组细胞 KLK11蛋白表达水平最低，与对照组及阴性对照组细胞比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；HCT-8/L-OHP细胞对奥沙利铂的IC50=54.72μmol/L；KLK11沉默HCT-8/L-OHP细胞对奥沙利铂的IC50=23.37μmol/L；对不同浓度L-OHP作用下的两组细胞的抑制率进行比较，差异均具有统计学意义（P＜0.01）；随着药物浓度的逐渐增加，奥沙利铂对HCT-8/L-OHP耐药细胞和KLK11沉默HCT-8/L-OHP细胞增殖的抑制效果均逐渐增强，呈明显剂量-效应关系，且奥沙利铂对KLK11沉默细胞的抑制效果明显强于HCT-8/L-OHP细胞；当L-OHP浓度为160umol/L时，几乎完全抑制了KLK11沉默细胞的生长；干扰前和干扰细胞的细胞周期分布差异具有统计学意义（P＜0.01）；其中，KLK11沉默HCT-8/L-OHP细胞G2/M期细胞减少，S期、G0/G1期细胞增加。结论：KLK11-RNAi(41638-1)的慢病毒表达载体能有效地抑制HCT-8/L-OHP细胞的KLK11 mRNA、KLK11蛋白的表达，提高化疗药物L-OHP对HCT-8/L-OHP的抑制率，成功地逆转结肠癌耐药细胞株对L-OHP的耐药性，在细胞分子水平上进一步验证了奥沙利铂的耐药性可能与KLK11的高表达有关。

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前言

第一部分 人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-8的建立和鉴定

引言

材料与方法

结果与分析

讨论

结论

第二部分 人结肠癌耐奥沙利铂细胞株HCT-8的差异基因研究

引言

材料与方法

结果与分析

讨论

结论

第三部分KLK11-si RNA慢病毒表达载体的构建及对结肠癌耐药细胞株的逆转作用

引言

一、靶向KLK11基因siRNA慢病毒载体的构建与鉴定

二、KLK11沉默HCT-8/L-OHP细胞株建立

三、KLK11-siRNA慢病毒载体对结肠癌细胞株耐奥沙利铂的影响1 材料

参考文献

综述:肿瘤化疗耐药与逆转的研究进展

在读期间发表论文情况

致谢