BMP I型受体抑制剂建立小鼠颅面发育畸形模型的实验研究

摘要

背景： 颅面发育畸形，是人类中最常见的先天发育缺陷，最常见的包括唇裂伴发或不伴发腭裂和腭裂，发病率约为1/700。唇腭裂严重影响病人的功能和美观，并且需要漫长的序列治疗。目前对于其病因的理解多集中于基因因素。然而越来越多的动物模型和临床研究显示，环境因素也是唇腭裂形成的重要病因。既往研究发现，胚胎发育时期，BMP信号在颅面发育中起重要作用，改变BMP信号会导致多种颅面发育畸形，包括腭裂。然而BMP信号是否能被外源性的药物抑制从而影响颅面发育形成仍未有研究。 目的： 探索是否能使用LDN-193189应用于体内干预BMP信号，从而影响颅面发育畸形，产生模拟基因突变产生的表型。包括： 1.建立稳定的颅面发育畸形小鼠模型，分析体内抑制BMP信号产生的一系列表型； 2.并对抑制BMP信号所形成的颅面发育畸形分不同表型进行深入的机制研究，本实验中先集中讨论腭裂。 材料和方法： 1.12只C57BL/6J孕鼠随机分为4组，每组3只，各组孕鼠通过腹腔注射分别给予BMP I型受体小分子抑制剂LDN-1931890，3，6，9mg/kg，给药时间为从E10.5天起至E15.5天，每天两次。取各组E16.5天的胎鼠于体式镜下观察颅面形态和图像采集，并对颅面上下颌部进行测量分析，根据结果从而确定后续研究的最佳致畸剂量。并且利用HE染色，Masson染色，Micro-CT，详细分析最佳剂量组中的颅面发育畸形的特点。 2.为了研究小鼠颅面发育畸形中腭裂形成的机制，重新取24只孕鼠随机分对照组和实验组，于10.5天起利用最佳致畸剂量给药，于E12.5，E13.5，E14，E14.5取胎鼠，体式镜观察后利用HE染色观察腭形成过程继发腭前后向的形态；并利用E13.5腭器官体外培养，观察腭上抬延迟是否受到小下颌及舌畸形影响；采用免疫组化观察腭板BMP-Smad经典通路下游蛋白（p-Smad1/5/8）和BMP-nonSmad非经典通路游蛋白（p-p38，p-Erk1/2），并检测细胞增殖磷酸化组蛋白3（p-H3）。 结果： 1. BMP I型受体抑制剂LDN-193189的最佳致畸剂量为6mg/kg，由于其有较高的致畸率，较小的致死率和胚胎毒性。在6mg/kg组中出现多种颅面畸形：包括完全性腭裂，腭前部裂，下颌骨发育不良，Meckel软骨前端联合处未融合，颏舌肌附着异常，下唇裂，腭骨发育不良等稳定表型。 2.胚胎腭发育时期，实验组和对照组的腭板垂直生长期E12.5，E13.5的形态及大小并无明显差异，然而腭板上抬期 E14，E14.5，实验组表现为明显的上抬延迟。E14.5下颌表现为明显的小下颌。去除下颌和舌后进行腭器官体外培养发现，实验组相对对照组，腭能正常上抬，然而不能成功接触并融合；免疫组化结果显示实验组在腭板垂直生长期E12.5，E13.5 BMP/Smad信号（p-Smad1/5/8）的显著性降低，然而BMP/non Smad信号（p-p38，p-Erk1/2）并无显著差异。同时实验组中细胞增殖指标p-H3显著下降。 结论： 1.在胚胎发育时期，我们首次证明外源性使用BMP I型受体抑制剂LDN-193189可导致胎鼠产生多种特异性的颅面发育畸形表型，该表型与BMP I型受体（ALK2，ALK3）基因突变的表型相似。 2.BMPI型受体抑制剂LDN-193189导致的胎鼠完全性腭裂及腭前部分裂，与小下颌及舌异常阻碍导致的腭上抬延迟以及腭板垂直生长过程中腭间充质细胞增殖率下降相关。LDN-193189特异性抑制BMPI型受体可降低BMP/Smad信号而非BMP/non Smad信号，从而抑制腭间充质细胞的增殖影响腭发育过程。本实验建立了新型致畸源性的小鼠腭裂模型。

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前言

1. 颅面发育畸形-腭裂

2. BMP信号通路概况

3.国内外关于BMP I型受体介导的信号与颅面发育关系的研究

4.BMP I型受体小分子抑制剂用于建立小鼠颅面发育畸形模型的可行性

第一部分利用LDN-193189建立稳定的颅面发育畸形小鼠模型

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1．LDN-193189用于小鼠体内试验的文献回顾

2．LDN-193189最佳致畸剂量的体内致畸性实验

3. 颅面正侧位投影测量分析

4．LDN-193189可致完全腭裂和腭前部分裂

5. LDN-193189可致颏舌肌附着异常

6．LDN-193189可致Meckel软骨及下颌骨发育不良

7. LDN-193189可致腭骨发育不全

讨论

1. 确定LDN-193189的最佳致畸剂量

2. 颅面正侧位投影测量分析

3. LDN-193189可致完全腭裂和腭前部分裂

4. LDN-193189可致Meckel软骨、下颌骨发育不良、颏舌肌附着异常、下唇裂

5. LDN-193189可致腭骨发育不全

第二部分分析LDN-193189引起腭裂畸形的组织学/分子学机制

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1. 腭发育过程中腭上抬延迟

2.腭上抬时期E14.5小鼠下颌表型分析

3. 腭器官培养

4. 腭板中Smad和Non-Smad信号的表达改变

5. 腭板细胞增殖下降

讨论

全文总结

参考文献

综述:BMP信号通路和颅颌面形成

个人简历

致谢