高迁移率族蛋白1通过MAPK及PI3K/AKT通路诱导皮肤鳞状细胞癌转移

摘要

目的：检测人皮肤鳞癌细胞系SCC13细胞表达高迁移率族蛋白1（high mobility group box1，HMGB1）水平；探讨HMGB1在体外条件下对SCC13细胞迁移能力的影响；探讨HMGB1对SCC13细胞MAPK及PI3K/AKT信号通路的作用，进而探讨HMGB1诱导SCC13细胞迁移过程中的作用机制，对寻找抑制皮肤鳞状细胞癌（cutaneous squamous cell carcinoma,CSCC）转移的药物具有重要的意义。 方法： 1、常规体外培养SCC13细胞和A431细胞，通过Western Blot试验及酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）分析比较SCC13细胞和A431细胞上清液中HMGB1水平差异； 2、运用Transwell趋化实验检测不同浓度HMGB1、不同处理时间条件下对SCC13细胞体外迁移能力的影响：①在不同处理时间（3h、6h、12h）下运用相同浓度HMGB1（100ng/ml）处理SCC13细胞，结晶紫染色后于显微镜下拍照，统计聚碳酸酯膜下层的细胞数，每个样本随机计数5个视野(200×)，取平均值；②设不含HMGB1的DMEM液为空白组，在相同处理时间（12h）下运用不同浓度HMGB1（10ng/ml、30ng/ml和100ng/ml）处理SCC13细胞，同样方法计数细胞。每个实验组重复3次。 3、Western Blot检测MAPK及PI3K/AKT信号通路相关蛋白：P-p42/44 MAPK和P-p38 MAPK，P-AKT和P-p85 PI3K表达差异。设置实验分组：①空白组：常规体外培养SCC13细胞；②实验组：用100ng/ml HMGB处理SCC13细胞24h；③对照组：用HMGB1拮抗剂甘草酸（Glycyrrhizin，GR）100μM处理SCC13细胞24h；④对照组：HMGB1和GR共同处理SCC13细胞24h。 结果： 1、SCC13细胞上清液中HMGB1水平显著高于A431细胞。运用Western Blot和ELISA两种方法同时检测两细胞上清液中HMGB1表达水平，两种实验方法结果一致：Western Blot：SCC13细胞HMGB1相对表达水平（4.8）高于A431细胞（1.2），差异有统计学意义（P<0.01）；ELISA：SCC13细胞HMGB1表达水平（483ng/ml）同样显著高于A431细胞（99ng/ml），差异具有统计学意义（P<0.001）。 2、不同处理时间条件下（3h、6h、12h），相同浓度HMGB1（100ng/ml）促进SCC13细胞的迁移能力水平随时间递增，并且在12h达到峰值，差异具有统计学意义（P<0.05；P<0.0001）；相同处理时间（12h）下运用不同浓度HMGB1（10ng/ml、30ng/ml和100ng/ml）处理SCC13细胞,迁移细胞数量随时间递增，且在100ng/ml达到峰值，与空白对照组对比具有显著的差异（P<0.0001）。 3、与空白对照组和抑制剂组相比，实验组细胞MAPK及PI3K/AKT信号通路中P-p42/44 MAPK和P-p38 MAPK，P-AKT和P-p85 PI3K等蛋白的表达水平显著升高，HMGB1能活化MAPK及PI3K/AKT信号通路，进而促进SCC13细胞的迁移。 结论： 1、SCC13细胞的HMGB1分泌水平显著高于A431细胞。 2、HMGB1对SCC13细胞的迁移能力有促进作用，并且该作用具有时间-剂量依赖性效应。 3、HMGB1能够通过上调MAPK信号通路中P38和P42/44 MAPK蛋白、PI3K/AKT信号通路中AKT和PI3K蛋白的磷酸化水平进而活化MAPK及PI3K/AKT信号通路，从而促进SCC13细胞的迁移。HMGB1有望成为抑制皮肤鳞状细胞癌转移的治疗靶点。

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缩略语表

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前言

材料和方法

1实验材料与试剂

1.1实验细胞

1.2 实验试剂

1.3 主要实验仪器及设备

1.4 主要试剂的配制

2 实验方法

2.1 细胞培养及分组

2.2 Western Blot检测蛋白的表达

2.3 Transwell 体外迁移实验

2.4 ELISA测定细胞上清液HMGB1水平：

2.5 统计学方法

结果

1.SCC13细胞的HMGB1分泌水平高于人表皮癌A431细胞。

2.HMGB1能促进SCC13细胞迁移，该作用具有时间-剂量依赖性效应

3.HMGB1能够通过上调MAPK信号通路中P38和P42/44 MAPK，PI3K/AKT信号通路中AKT和PI3K的磷酸化水平进而活化MAPK及PI3K/AKT信号通路

讨论

结论

参考文献

综述:SOX蛋白与黑素瘤研究进展

致谢