HINT2基因表达下调在结直肠癌细胞上皮细胞间质转化过程中的作用及其机制研究

摘要

【研究背景及目的】 结直肠癌是一种常见的恶性肿瘤，转移、复发是该病的主要死因，其转移机制已成为目前的研究热点。近年来，越来越多研究表明上皮细胞间质转化（EMT）对结直肠癌细胞侵袭、转移能力的增强发挥关键作用。Martin等学者研究表明，三联组氨酸结合蛋白2（Histidine triad nucleotide-binding2，HINT2)对肿瘤组织的生长起抑制作用，且该蛋白可诱导肿瘤细胞凋亡。我们前期研究发现，结肠癌组织中HINT2表达量明显低于正常结肠组织，且HINT2对 SW480结肠癌细胞的迁移、侵袭能力具有抑制作用。因此，本课题的目的是探究 HINT2在结直肠癌细胞EMT中的作用，并探讨相关的分子机制。 【实验方法】 1.建立稳定沉默HINT2的SW480细胞系 将结肠癌细胞系SW480感染重组慢病毒Hint2 shRNA(h) Lentiviral Particles（sc-92707-V）的方法敲除HINT2，并用有限稀释克隆法建立稳定沉默细胞系。 2.检测HINT2对SW480结肠癌细胞株 EMT的影响 2.1.利用慢病毒Hint2 shRNA(h) Lentiviral Particles感染结直肠癌细胞株SW480，下调细胞株中 HINT2表达，显微镜下观察细胞形态变化，利用Western blot方法检测HINT2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达量变化情况。 2.2.构建包含E-cadherin启动子结合位点的报告基因质粒，转染入Hint2 shRNA(h) Lentiviral Particles、Control shRNA Lentiviral Particles-A的SW480细胞株，通过检测荧光素酶表达水平预测HINT2对E-cadherin基因转录的调节作用。 3.观察HINT2变化对SW480结直肠癌细胞株迁移及侵袭能力的影响用细胞划痕试验及Transwell试验检测不同HINT2表达水平对SW480细胞迁移、侵袭能力的影响。 4.探讨HINT2抑制SW480细胞EMT的分子机制 4.1.利用Real-time PCR检测下调HINT2表达对SW480细胞EMT相关转录因子SNAI1、SNAI2、ZEB1、ZEB2、TWIST1、TWIST2表达的影响。 4.2.制备HINT2与ZEB1双干扰慢病毒HINT2+ZEB1 shRNA Lentiviral Particles。 4.3.利用慢病毒Hint2 shRNA(h) Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 shRNA LentiviralParticles或Control shRNA Lentiviral Particles-A感染结肠癌细胞株SW480，利用Western blot方法检测HINT2、ZEB1、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin表达量变化情况。 4.4.构建包含E-cadherin启动子结合位点的报告基因质粒，转染入Hint2 shRNA(h) Lentiviral Particles、HINT2+ZEB1 shRNA Lentiviral Particles或Control shRNA Lentiviral Particles-A的SW480细胞株，通过检测荧光素酶表达水平预测ZEB1在HINT2介导的E-cadherin基因转录调节中的作用。 5.统计学分析 釆用SPSS22.0进行统计分析，所有的结果都以均数±标准差表示，采用t检验，P<0.05有统计学意义。 【实验结果】 1.成功建立低表达HINT2的SW480细胞系。 2.在SW480细胞中小干扰HINT2后，细胞形态由浑圆变得细长，出现梭形触角，E-cadherin表达下降，N-cadherin、Vimentin表达量明显上升。 3.荧光素酶报告基因试验结果显示HINT2通过转录水平促进E-cadherin表达。 4.利用慢病毒载体下调HINT2表达后，细胞划痕试验及Transwell方法检测结果显示HINT2显著抑制SW480细胞的侵袭、迁移能力。 5.在SW480细胞中同时干扰HINT2及ZEB1后，EMT分子标记物（E-cadherin、N-cadherin、Vimentin）表达量相较对照组无明显变化。荧光素酶报告基因试验结果显示在SW480细胞中同时干扰HINT2及ZEB1，E-cadherin启动子活性相较对照组未发生变化。 【结论】 1. HINT2可抑制SW480结直肠癌细胞的 EMT。 2. HINT2可正性调控SW480结直肠癌细胞E-cadherin的转录。 3. HINT2可有效抑制结直肠癌细胞的迁移侵袭能力。 4. ZEB1是低表达HINT2诱导结直肠癌细胞EMT所必需的。 5.低表达HINT2对E-cadherin转录活性的负性调控依赖于ZEB1表达。

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缩略词表

前言

材料与方法

一、 实验材料

二、 实验方法

结果

一、 HINT2可抑制SW480结直肠癌细胞的EMT过程

二、 HINT2可抑制SW480结直肠癌细胞的迁移、侵袭能力

三、 HINT2影响结直肠癌细胞上皮间质转化相关机制研究

讨论

结论

参考文献

综述:上皮细胞间质转化与肿瘤转移

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