5-HT6受体拮抗剂SB271046对氯化锂匹罗卡品致痫大鼠脑内谷氨酸、γ-氨基丁酸的影响

摘要

目的:本文通过建立氯化锂匹罗卡品慢性癫痫大鼠模型，给予5-HT6受体拮抗剂SB271046干预，观察大鼠慢性期自发性发作变化。采用WB与RT-PCR方法检测谷氨酸、γ-氨基丁酸合成酶的表达水平；利用高效液相色谱法检测海马组织谷氨酸与γ-氨基丁酸合成酶的含量，探讨5-HT6受体拮抗剂减少痫性发作的可能机制。 方法: 1.动物分组：成年雄性SD大鼠分为两组：空白对照组（Vehicle组，n=10），氯化锂-匹罗卡品组(LiCl-PILO组，n=40）。首先根据注射LiCl-PILO后是否出现癫痫持续状态（Status Epilepticus，SE），出现SE者纳入实验，未出现SE和死亡者则剔除；然后再随机分组：模型组（EP组）、安慰剂组（EP+DMSO)即侧脑室注射二甲基亚砜（DMSO)，4ul；10ugSB-271046药物组（10ug-SB组）即侧脑室注射(SB-271046)剂量为10ug，4ul；20ugSB-271046药物组（20ug-SB组）即侧脑室注射SB-271046剂量为20ug，4ul，30ugSB-271046药物组（30ug-SB组）即侧脑室注射SB-271046剂量为30ug，4ul。 2.制作氯化锂匹罗卡品癫痫模型:腹腔注射氯化锂，16-20小时后腹腔注射匹罗卡品，根据Racine分级，发作级数达4级或者4级以上且能持续30min，为造模成功。采用Veliskova和Goffin.K等评分法观察癫痫大鼠慢性期自发性发作。 3.药物干预：根据Watson《大鼠脑立体定位图谱》，利用脑立体定位仪在致痫大鼠慢性期给予侧脑室注射DMSO、5-HT6受体拮抗剂SB271046，连续给药3天。给药结束后处死大鼠，收集海马组织标本。 4.通过Western Blot（WB）检测海马谷氨酸脱羧酶GAD65、GAD67（Glutamic acid decarboxylase）谷氨酰胺酶GLS（Glutaminase）的变化。 5.逆转录多聚酶链反应（RT-PCR）检测GAD65、GAD67、GLS mRNA在各组的表达。 6.HPLC法测定各组海马组织中谷氨酸、γ-氨基丁酸的含量。 结果: 1.氯化锂匹罗卡品慢性癫痫大鼠模型的建立：造模成功率及死亡率：第1批大鼠造模成功率为87.5%，造模后4周存活率为65%；第2批大鼠造模成功率为92.5%，造模后4周存活率为60%；第3批大鼠造模成功率为77.5%，造模后4周存活率为40%。 2.5-HT6受体拮抗剂SB271046对致痫大鼠慢性期自发性发作的影响：癫痫大鼠进入慢性期仍有自发性反复的发作，5-HT6受体拮抗剂干预，能够减少慢性期发作的次数以及级数。 3.5-HT6受体拮抗剂SB271046对致痫大鼠慢性期海马部位GAD65、GAD67、GLS蛋白水平的影响：①与vehicle组相比，EP组GAD65水平降低，SB干预后GAD65水平升高，以20ug-SB组和30ug-SB组明显。②与vehicle组相比，EP组GAD67水平降低，SB干预后GAD67水平均有升高。③与vehicle组相比，EP组GLS水平升高，SB干预后GLS水平降低，以30ug-SB组明显。 4.5-HT6受体拮抗剂SB271046对致痫大鼠慢性期海马部位GAD65、GAD67、GLS mRNA水平的影响：①与vehicle组相比，EP组GAD65mRNA水平降低，SB干预后的GAD65水平均升高。②与vehicle组相比，EP组GAD67mRNA水平降低，SB干预后的GAD67水平均升高。③与vehicle组相比，EP组GLS mRNA水平升高，SB干预后GLS水平降低，以20ug-SB组和30ug-SB组明显。 5.5-HT6受体拮抗剂SB271046对致痫大鼠慢性期海马部位GLU、GABA水平的影响：与vehicle组相比，EP组GLU/GABA明显升高，EP组与EP+DMSO组之间无明显差别（p=0.581），与EP组相比，SB干预后GLU/GABA有下降的趋势，EP+10ugSB组（p=0.122），EP+30ugSB组（p=0.081）。 结论: 1.5-HT6受体拮抗剂SB-271046可以减少慢性癫痫大鼠自发性发作 2.5-HT6受体拮抗剂SB271046可以改善慢性癫痫大鼠谷氨酸脱羧酶（GAD65、GAD67）、谷氨酰胺酶（GLS）异常表达。 3.5-HT6受体拮抗剂可能通过改变谷氨酸脱羧酶（GAD65、GAD67）、谷氨酰胺酶（GLS)的表达来调节海马部位γ-氨基丁酸、谷氨酸的水平，从而起到抗癫痫的作用。

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前言

材料

1.实验动物

2.主要实验仪器

3. 主要材料试剂

4. 溶剂的配制

方法

1.总体实验方案

2.动物模型的建立

3.慢性期大鼠行为学观察

4.侧脑室注射

5.标本收集

6.Western blot

7.Real-time PCR

8.高效液相色谱法[37]

9.统计分析

结果

1. 5-HT6受体拮抗剂SB271046对致痫大鼠慢性期行为学的影响。

2.5-HT6受体拮抗剂SB271046对GAD65、GAD67蛋白表达水平的影响。

3.5-HT6受体拮抗剂SB271046对GLS蛋白表达水平的影响。

4.5-HT6受体拮抗剂SB271046对GAD65、GAD67、GLS的mRNA水平的

5.高效液相色谱法检测5-HT6受体拮抗剂SB271046对海马组织中GLU及GABA水平的影响。

讨论

1、5-HT6受体拮抗剂对匹罗卡品致痫大鼠慢性期自发性发作的影响

2、5-HT6受体拮抗剂对匹罗卡品致痫大鼠慢性期海马GAD的影响

3、5-HT6受体拮抗剂对匹罗卡品致痫大鼠慢性期海马GLS的影响

4、5-HT6受体拮抗剂对匹罗卡品致痫大鼠慢性期海马谷氨酸与γ-氨基丁酸水平的影响

结论

参考文献

综述: 5-HT6受体调控脑内乙酰胆碱、谷氨酸、γ-氨基丁酸的研究进展

致谢