胃癌免疫微环境分型及PD-L1/PD-1与MICA/NKG2D调节胃癌免疫逃逸的研究

摘要

目的：⑴根据组织微环境中PD-L1状态、CD8+T细胞浸润情况以及MICA状态初步对胃癌的免疫分型，探索各个关键分子及不同分型的胃癌临床病理学特征及预后；⑵探索IFN-γ通过JAKs-STATs通路调控胃癌细胞PD-L1及MICA表达的机制；⑶体外研究MICA/NKG2D和PD-1/PD-L1共同调节胃癌细胞免疫逃逸的机制；⑷研究肿瘤微环境中MICA与PD-L1状态对胃癌接受细胞因子诱导的杀伤细胞疗效影响。
　　方法：①纳入胃癌接受D2根治术后且接受系统术后辅助治疗的患者，采用特异性抗体(SP142、SP16)，免疫组化检测肿瘤微环境中PD-L1和CD8+T细胞浸润程度，同时对相关指标建立相应的评分体系，最终将胃癌分为四种不同免疫亚型，同时检测肿瘤细胞MICA的表达，分析各个关键分子及不同免疫分型的临床病理特征及预后。②IFN-γ干预胃癌细胞株， Western blot及RT-qPCR检测IFN-γ干预前后PD-L1和MICA的表达变化情况，同时检测下游JAKs/STATs通路关键分子的磷酸化及总蛋白变化情况；进一步选用特异性蛋白抑制剂、CRISPR-Cas9基因敲除的技术来验证 IFN-γ调控PD-L1和MICA表达的下游分子信号机制；③采用转染过表达载体、CRISPR/Cas9敲除基因等技术，构建不同表型状态（PD-L1、MICA）的胃癌细胞株，体外扩增特异性的CD8+T细胞以及非特异杀伤细胞NKT细胞，采用LDH法、抗体封闭实验等，探索MICA/NKG2D和PD-1/PD-L1如何共同调节特异性杀伤细胞以及非特异性杀伤细胞的杀伤效应。④回顾性分析我院2009-2011年胃癌患根治术后患者，同时接受了术后标准的辅助化疗和至少2个周期CIK辅助治疗方案。
　　结果：⑴在186个样本中，60.3%（112/186）的患者PD-L1阳性表达（TC=1/2/3或者IC=1/2/3）。PD-L1的表达强度与CD8+T细胞浸润数量之间存在显著相关性（P=0.000）。根据免疫相关的分类，I型（CD8+T+/PD-L1+）、II型（CD8+T-/PD-L1-）、III型（CD8+T-/PD-L1+）、IV型（CD8+T+/PD-L1-）分别占60.3%，11.8%，0%，和27.9%。II型患者DFS、OS显著劣于I型和IV型患者；I型和IV型患者之间的DFS、OS无显著统计学差异（I型和II型，P=0.015，P=0.003；IV型和II型，P=0.017，P=0.005；I型和IV型，P=0.806，P=0.808；）。另外，MICA低表达116例，占62.4%；高表达70例，占37.6%。MICA蛋白表达状态与肿瘤分期存在明显相关，p=0.002。MICA表达与PD-L1显著负相关，p=0.027；同时， MICA表达与CD8+T细胞浸润及免疫分型均存在交界性相关（p=0.081,p=0.061）。⑵IFN-γ干预胃癌细胞0、4、12、24h后，PD-L1蛋白表达与mRNA表达量上调，MICA蛋白表达及mRNA表达量出现下调，存在时间-效应关系。Western blot分见pJAK1、pJAK2以及pSTAT1活化最明显，且其表达与MICA及PD-L1同步；应用特异性的JAK1,JAK2抑制剂或者CRISPR/Cas9敲除STAT1基因，均可抑制IFN-γ诱导PD-L1上调表达以及MICA下调表达这一分子现象。⑶LDH法检测结果显示：CD8+T细胞杀伤对MICAko/PD-L1oe-BGC-823细胞杀伤率低于PD-L1ko-BGC-823以及PD-L1oe-BGC-823（p<0.05,p<0.001），对MICAoe/PD-L1ko- BGC-823的杀伤效率显著高于 MICAoe-BGC-823以及MICAko-BGC-823(p<0.01,p<0.001）。而 NKT细胞对 PD-L1ko-BGC-823、PD-L1oe-BGC-823以及 MICAko/PD-L1oe-BGC-823杀伤率无显著差异；对MICAoe/PD-L1ko-BGC-823以及MICAoe-BGC-823的杀伤效率无统计学差异（p>0.05），但均显著高于MICAko-BGC-823（p<0.001,p<0.001）。NKG2D单抗封闭CD8+T细胞后，可见到CD8+T细胞对PD-L1oe-BGC-823的杀伤率显著下调（p<0.01），而NKG2D+PD-1单抗联合封闭CD8+T细胞后，对比PD-1单抗单独封闭发现，两抗体同时封闭对PD-L1oe-BGC-823的杀伤率明显下降（p<0.001）。⑷95例胃癌术后接受辅助化疗联合CIK患者中，MICA低表达57例（60%），高表达38例（40%）。PD-L1阴性41例（43.2%），阳性54例（56.8%）。MICA高表达的患者，DFS和OS明显优于MICA低表达的患者，分别为46.0月 vs.41.0月(p=0.027)、48.0月 vs.42.0月(p=0.031)，而PD-L1状态与DFS及OS无明显相关。多因素COX回归模型显示，肿瘤分期及MICA蛋白表达状态是胃癌术后接受CIK治疗DFS及OS的独立预测因素。
　　结论：①在胃癌组织中，CD8+T细胞浸润程度是胃癌的独立预后因素。PD-L1表达与CD8+T细胞浸润程度显著相关。我们的研究中，III型胃癌缺失，II型预后明显差于I型和IV型。MICA表达与PD-L1存在显著的负相关。②IFN-γ可以显著诱导胃癌细胞PD-L1上调表达，同时出现MICA诱导性下调，这两个分子事件均依赖于JAK1/2-STAT1的磷酸化。③MICA/NKG2D以及PD-1/PD-L1共同调控了CD8+T细胞对胃癌细胞的杀瘤效应，MICA的下调可能是PD-1单抗在PD-L1阳性胃癌的一个原发耐药机制。④胃癌术后接受化疗联合CIK治疗的患者，肿瘤组织MICA蛋白高表达是接受CIK治疗的疗效较好的预测因素，而PD-L1的状态对患者的生存无显著影响。

目录

声明

英 文 缩 略 词 表

前言

第一部分 基于组织微环境中PD-L1状态和CD8+T细胞浸润为基础的胃癌免疫分型

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第二部分 IFN-γ调控胃癌细胞PD-L1及MICA表达的机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第三部分：MICA/NKG2D和PD-1/PD-L1共同调节胃癌细胞株免疫逃逸的机制研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

第四部分：肿瘤微环境中MICA与PD-L1状态对胃癌接受细胞因子诱导的杀伤细胞疗效影响的研究

引言

材料与方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述：胃癌免疫治疗的现状及展望

致谢